Wnt5a-Ca2+-Calcineurin-NFAT通路信號(hào)分子在黑素瘤中的表達(dá).pdf

1、惡性黑素瘤（MM）是致死率最高的皮膚腫瘤，此腫瘤特點(diǎn)是惡性程度高、易于轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差、死亡率較高，五年生存率低于11％。目前的治療方法仍不令人滿意，尤其是轉(zhuǎn)移性黑素瘤。至今尚不完全清楚惡性黑素瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)理，如果能揭示某些與惡性黑素瘤侵襲和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)的重要因素，尤其是闡明參與黑素瘤細(xì)胞移動(dòng)、浸潤(rùn)能力調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將對(duì)侵襲性黑素瘤的分子識(shí)別及靶向治療非常重要。文獻(xiàn)報(bào)道在人體腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)、增殖及浸潤(rùn)中Ca2+發(fā)揮積極調(diào)控作用

2、，在腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中Ca2+介導(dǎo)的信號(hào)也是一個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)，有關(guān)Wnt/Ca2+信號(hào)通路與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系已成為研究者關(guān)注的熱點(diǎn)，但其確切的調(diào)控機(jī)理仍不是特別清楚?；罨疶細(xì)胞核因子（NuclearfactorofactivatedT-cells，NFAT）最早發(fā)現(xiàn)于T細(xì)胞內(nèi)，是一種Ca2+依賴的的轉(zhuǎn)錄因子，大量研究認(rèn)為它和人體多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。根據(jù)目前的研究結(jié)果，結(jié)合我們實(shí)驗(yàn)組的前期研究，我們認(rèn)為，在一些腫瘤細(xì)胞中存

3、在一條Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路，這條信號(hào)通路可能在黑素瘤中被激活，并參與了黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程。如果能通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)這條信號(hào)通路的存在，并明確其作用及調(diào)控機(jī)理，將為闡明惡性黑素瘤的發(fā)病機(jī)理起到重要作用，并為黑素瘤患者的靶向治療提供重要的理論依據(jù)。為此，我們首先分離、培養(yǎng)正常皮膚黑素細(xì)胞及來源于不同生長(zhǎng)期的三株黑素瘤細(xì)胞系，采用RT-PCR法和Western-blot法檢測(cè)Wnt5a/Ca2+/Cal

4、cineurin/NFAT信號(hào)通路中主要的信號(hào)分子Wnt5a、DVL（散亂蛋白）、Calcineurin(鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶)、NFAT2、COX-2(環(huán)氧合酶2)、VEGF（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子）、Vinculin（紐帶蛋白）、Vimentin（波形蛋白）的表達(dá)水平，再用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)這四株細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，最后用免疫組化檢測(cè)色素痣（良性黑素細(xì)胞腫瘤）及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤的臨床組織標(biāo)本中NFAT2和Calcineurin

5、-B的表達(dá)。目的是證實(shí)Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路在不同發(fā)展期黑素瘤細(xì)胞中的激活狀態(tài)。
　　實(shí)驗(yàn)一Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT通路信號(hào)分子在正常黑素細(xì)胞和不同生長(zhǎng)期黑素瘤細(xì)胞中的表達(dá)
　　采用RT-PCR和Western-blot方法，檢測(cè)了皮膚正常黑素細(xì)胞和分別來源于原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的WM793B、LIBR和SK-MEL-5惡性黑素瘤細(xì)胞系中Wnt5a、D

6、VL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin及Vimentin八個(gè)信號(hào)分子的表達(dá)。結(jié)果顯示：Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2及COX-2等八個(gè)分子在皮膚正常黑素細(xì)胞中表達(dá)較弱，而在其它3株不同生長(zhǎng)期黑素瘤細(xì)胞中均有不同程度的高表達(dá)，表達(dá)強(qiáng)度在各株黑素瘤細(xì)胞之間有一些差異，但在不同生長(zhǎng)期惡性黑素瘤細(xì)胞中并未呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)。我們認(rèn)為，Wnt5a/Ca2+/Calcineu

7、rin/NFAT信號(hào)通路在黑素瘤細(xì)胞中被激活，可能參與了惡性黑素瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程。
　　實(shí)驗(yàn)二激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)正常黑素細(xì)胞和不同生長(zhǎng)期黑素瘤細(xì)胞中的Ca2+濃度
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用激光共聚焦掃描顯微鏡檢技術(shù)，檢測(cè)了皮膚正常黑素細(xì)胞和分別來源于原位、侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的WM793B、LIBR、SK-MEL-5惡性黑素瘤細(xì)胞系中的Ca2+濃度。結(jié)果顯示：在皮膚正常黑素細(xì)胞中Ca2+濃度較低，而在其它3株不同生長(zhǎng)期黑素

8、瘤細(xì)胞中Ca2+濃度均有不同程度的升高，熒光強(qiáng)度在各株黑素瘤細(xì)胞之間有一定差異，但在不同生長(zhǎng)期惡性黑素瘤細(xì)胞中并未呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)。黑素瘤細(xì)胞中Ca2+濃度的增高提示Ca2+的濃度變化可能參與了黑素瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移過程，可能在Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路調(diào)控黑素瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有關(guān)鍵作用。
　　實(shí)驗(yàn)三免疫組化檢測(cè)NFAT和Calcineurin在色素痣及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織標(biāo)本中的

9、表達(dá)
　　本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色方法，檢測(cè)了色素痣標(biāo)本（30例）以及原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤組織標(biāo)本（各10例）中NFAT2和Calcineurin-B的表達(dá)。結(jié)果顯示：NFAT2蛋白主要表達(dá)于胞漿及胞核，而Calcineurin-B主要表達(dá)于胞漿。在30例色素痣中兩種信號(hào)分子的表達(dá)皆為陰性，而NFAT2在原位（2例）、侵襲性（8例）和轉(zhuǎn)移性(9例)黑素瘤臨床組織標(biāo)本中呈陽性表達(dá)，其在黑素瘤臨床組織標(biāo)本中的陽性表達(dá)率為63％

10、，與色素痣的陰性表達(dá)具有顯著差異（P<0.001）。在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤臨床標(biāo)本中強(qiáng)陽性表達(dá)分別為6例及7例，而原位黑素瘤中無1例為強(qiáng)陽性表達(dá)，提示隨著腫瘤的發(fā)展，其表達(dá)有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)。Calcineurin-B在色素痣細(xì)胞中均為陰性表達(dá)，而在原位（3例）、侵襲性（8例）和轉(zhuǎn)移性（9例）黑素瘤臨床組織標(biāo)本中呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率在色素痣和黑素瘤之間差異顯著（P<0.001）。在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤臨床標(biāo)本中強(qiáng)陽性表達(dá)分別為6例及7例

11、，而原位黑素瘤中也無1例為強(qiáng)陽性表達(dá)，其陽性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度與NFAT2一致，提示這兩種分子在不同發(fā)展階段的黑素瘤組織標(biāo)本中的表達(dá)具有動(dòng)態(tài)變化過程，Wnt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路可能在黑素瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。
　　綜上所述，在分別來源于原位、侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞系中Wnt5a、DVL2、Calcineurin、NFAT2、COX-2、VEGF-A、Vinculin和Vimen

12、tin在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均增高，但并不呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)的變化趨勢(shì)，而正常黑素細(xì)胞僅有低表達(dá)；黑素瘤細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度也較正常黑素細(xì)胞明顯增高，黑素瘤組織標(biāo)本中NFAT2和Calcineurin-B的表達(dá)明顯增強(qiáng)，且呈現(xiàn)出在侵襲性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤較原位黑素瘤表達(dá)更強(qiáng)的趨勢(shì)，而且這兩個(gè)分子的陽性表達(dá)率和表達(dá)強(qiáng)度具有一致性，提示W(wǎng)nt5a/Ca2+/Calcineurin/NFAT信號(hào)通路在黑素瘤中被激活，可能在黑素瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用