多環(huán)芳烴類化合物苯并芘對人臍靜脈內(nèi)皮細胞血栓調(diào)節(jié)蛋白表達的影響及機制研究.pdf

1、目的：
　　環(huán)境因素對心血管系統(tǒng)的影響愈發(fā)加重，煙草、石油等高分子有機物質不完全燃燒產(chǎn)生的多環(huán)芳烴類化合物苯并芘具有顯著的致癌作用，近年發(fā)現(xiàn)苯并芘能夠影響內(nèi)皮細胞的生理功能，參與動脈粥樣硬化進展，包括損害及斑塊形成。血栓調(diào)節(jié)蛋白廣泛表達在內(nèi)皮細胞上，參與內(nèi)皮細胞的抗炎、抗凝等作用，苯并芘是否會影響血栓調(diào)節(jié)蛋白的報道少見。Krüppel樣轉錄因子2被稱為內(nèi)皮細胞的“分子開關”，可以通過多種途徑影響內(nèi)皮細胞生理功能，使其處于功能靜止狀

2、態(tài)，有研究顯示Krüppel樣轉錄因子2可以上調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達。本研究探討苯并芘對人內(nèi)皮細胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白的影響及Krüppel樣轉錄因子2在這一影響中的作用。
　　方法：
　　分離培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞，VIII因子鑒定，第2~4代細胞用于實驗。分組：對照組：0.1％DMSO組，陽性對照組：20ng/ml TNF-a組，實驗組：四種不同濃度0.1mg/L,1mg/L,2mg/L,5mg/L的苯并芘溶液組，共六組。<

3、br>　?、貱CK8方法檢測0.1%DMSO及不同濃度苯并芘溶液不同時間(6h,24h)干預細胞后，各組的吸光度A值；
　?、谝陨蠞舛冉M不同時間(6h,24h)干預細胞及2mg/L苯并芘溶液不同時間(0h,1h,6h,12h,24h)干預細胞，熒光二抗標記血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體已標記的細胞，每組分別計數(shù)10000個細胞，流式細胞儀檢測并比較各組的平均熒光強度；
　?、鄹鳚舛冉M不同時間(6h,24h)干預細胞及2mg/L苯并芘溶液(

4、0h,1h,6h,12h,24h)干預細胞后，SYBR Green染料法RT-PCR檢測各組TM mRNA的表達；
　?、芨鳚舛冉M24h干預細胞及2mg/L苯并芘溶液不同時間(0h,1h,6h,12h,24h)干預細胞后，利用SYBR Green染料法進行RT-PCR檢測各組LKLF mRNA的表達；
　　⑤分別用LKLF siRNA，Control siRNA-A轉染細胞24小時后，再次用0.1%DMSO、2mg/L苯并芘

5、溶液分別孵育細胞24h，比較各組TM的平均熒光強度及TM mRNA的表達。
　　結果：
　?、俚捅剁R下觀察，細胞的形狀為短梭形、多角形，核仁清晰。VIII因子鑒定：95%以上的細胞染色陽性,含有棕色顆粒，為內(nèi)皮細胞。
　?、?4h組中，2mg/L，5mg/L組與對照組的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。6h組雖然有隨著濃度升高吸光度A值下降的趨勢，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)；
　?、?h及24h組均可觀察到隨

6、著苯并芘的濃度升高TM平均熒光強度較對照組有下降的趨勢，6h組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，24h組濃度達到0.1mg/L時的熒光強度即有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，同一濃度2mg/L組中，平均熒光強度有隨著時間延長而下降的趨勢，同0h相比較，1h及24h處平均熒光強度差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　?、芘c對照組相比，6h及24h組均可觀察到隨著苯并芘的濃度升高TMmRNA相對表達量2-△△Ct值有下降的趨勢，其中6h組

7、濃度達2mg/L時2-△△Ct值便有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，24h組中濃度達到0.1mg/L時即有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，在2mg/L組中，2-△△Ct值有隨著時間延長而下降的趨勢，同0h相比較，達到1h處差異便有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　?、莶煌瑵舛冉M可以觀察到隨著苯并芘濃度的升高，KLF2mRNA的表達量降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；同一濃度2mg/L不同時間組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。