多環(huán)芳烴類化合物苯并芘對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血栓調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　環(huán)境因素對(duì)心血管系統(tǒng)的影響愈發(fā)加重，煙草、石油等高分子有機(jī)物質(zhì)不完全燃燒產(chǎn)生的多環(huán)芳烴類化合物苯并芘具有顯著的致癌作用，近年發(fā)現(xiàn)苯并芘能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能，參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展，包括損害及斑塊形成。血栓調(diào)節(jié)蛋白廣泛表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞上，參與內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎、抗凝等作用，苯并芘是否會(huì)影響血栓調(diào)節(jié)蛋白的報(bào)道少見(jiàn)。Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2被稱為內(nèi)皮細(xì)胞的“分子開(kāi)關(guān)”，可以通過(guò)多種途徑影響內(nèi)皮細(xì)胞生理功能，使其處于功能靜止?fàn)?/p>

2、態(tài)，有研究顯示Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2可以上調(diào)血栓調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。本研究探討苯并芘對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞表面血栓調(diào)節(jié)蛋白的影響及Krüppel樣轉(zhuǎn)錄因子2在這一影響中的作用。
　　方法：
　　分離培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，VIII因子鑒定，第2~4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分組：對(duì)照組：0.1％DMSO組，陽(yáng)性對(duì)照組：20ng/ml TNF-a組，實(shí)驗(yàn)組：四種不同濃度0.1mg/L,1mg/L,2mg/L,5mg/L的苯并芘溶液組，共六組。<

3、br>　　①CCK8方法檢測(cè)0.1%DMSO及不同濃度苯并芘溶液不同時(shí)間(6h,24h)干預(yù)細(xì)胞后，各組的吸光度A值；
　?、谝陨蠞舛冉M不同時(shí)間(6h,24h)干預(yù)細(xì)胞及2mg/L苯并芘溶液不同時(shí)間(0h,1h,6h,12h,24h)干預(yù)細(xì)胞，熒光二抗標(biāo)記血栓調(diào)節(jié)蛋白抗體已標(biāo)記的細(xì)胞，每組分別計(jì)數(shù)10000個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)并比較各組的平均熒光強(qiáng)度；
　　③各濃度組不同時(shí)間(6h,24h)干預(yù)細(xì)胞及2mg/L苯并芘溶液(

4、0h,1h,6h,12h,24h)干預(yù)細(xì)胞后，SYBR Green染料法RT-PCR檢測(cè)各組TM mRNA的表達(dá)；
　　④各濃度組24h干預(yù)細(xì)胞及2mg/L苯并芘溶液不同時(shí)間(0h,1h,6h,12h,24h)干預(yù)細(xì)胞后，利用SYBR Green染料法進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)各組LKLF mRNA的表達(dá)；
　　⑤分別用LKLF siRNA，Control siRNA-A轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)后，再次用0.1%DMSO、2mg/L苯并芘

5、溶液分別孵育細(xì)胞24h，比較各組TM的平均熒光強(qiáng)度及TM mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?、俚捅剁R下觀察，細(xì)胞的形狀為短梭形、多角形，核仁清晰。VIII因子鑒定：95%以上的細(xì)胞染色陽(yáng)性,含有棕色顆粒，為內(nèi)皮細(xì)胞。
　?、?4h組中，2mg/L，5mg/L組與對(duì)照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。6h組雖然有隨著濃度升高吸光度A值下降的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；
　　③6h及24h組均可觀察到隨

6、著苯并芘的濃度升高TM平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組有下降的趨勢(shì)，6h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，24h組濃度達(dá)到0.1mg/L時(shí)的熒光強(qiáng)度即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，同一濃度2mg/L組中，平均熒光強(qiáng)度有隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)，同0h相比較，1h及24h處平均熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　④與對(duì)照組相比，6h及24h組均可觀察到隨著苯并芘的濃度升高TMmRNA相對(duì)表達(dá)量2-△△Ct值有下降的趨勢(shì)，其中6h組

7、濃度達(dá)2mg/L時(shí)2-△△Ct值便有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，24h組中濃度達(dá)到0.1mg/L時(shí)即有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，在2mg/L組中，2-△△Ct值有隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降的趨勢(shì)，同0h相比較，達(dá)到1h處差異便有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　?、莶煌瑵舛冉M可以觀察到隨著苯并芘濃度的升高，KLF2mRNA的表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；同一濃度2mg/L不同時(shí)間組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。