鹵醇脫鹵酶HheC的高效表達與純化及其酶活檢測方法的研究.pdf

1、鹵醇脫鹵酶可以催化合成具有光學純的環(huán)氧化物及β-取代醇等一類高價值手性藥物中間體。鹵醇脫鹵酶的高效重組表達及純化可以更好地促進該酶的應用。同時，針對鹵醇脫鹵酶在實際應用中的局限性，如對某些特定反應的低催化活性以及低立體選擇性等，需對酶進行合理改造，以擴大其應用范圍。為此，一種方便，靈敏的高通量篩選方法是非常必要的。
　　通過PCR擴增，將編碼鹵醇脫鹵酶的基因克隆至pBAD表達載體中，經測序鑒定后，將其轉入大腸桿菌TOP10中，對其

2、重組表達條件進行優(yōu)化，以提高蛋白表達量。同時，對該酶在已構建好的T7表達體系中的表達條件經也進行了優(yōu)化。經酶活測定及SDS-PAGE分析，選擇最優(yōu)條件進行大量表達(0.5 L)，在兩種表達體系中，可溶性目的蛋白的含量均大大提高，占總蛋白含量35％左右。采用Q-Sepharose陰離子交換層析技術一步純化，獲得純度為90%的鹵醇脫鹵酶，得率分別為68和82 mg/L。
　　為了從所構建的突變體文庫中有效地獲取有益的鹵醇脫鹵酶突變體，

3、我們建立了一個高通量的篩選方法-比色法。這個方法是依賴于苯酚紅指示劑在弱緩沖體系中，隨著酶的催化而使得質子釋放，造成了苯酚紅在559nm條件下的吸光度值發(fā)生改變,以此檢測反應體系中質子的釋放量,進而計算酶活。同時,通過對誘導表達條件的優(yōu)化,使得該方法能應用全細胞樣品并在96孔板中進行的。方法的驗證是使用鹵醇脫鹵酶 HheC的兩個特殊的突變體：D80N，W249F(對于底物1,3-DCP的kcat，D80N比WT低了200倍，W249F比