AGEs對(duì)大鼠BMSCs成骨分化過程中LRP5、Col-I mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、目的：
　　觀察AGEs對(duì)大鼠BMSCs增殖、分化的影響，觀察AGEs是否抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路中LRP5基因表達(dá),進(jìn)一步探索骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)理。
　　方法：
　　1.大鼠BMSCs的提取、培養(yǎng)及鑒定。
　　2.AGEs對(duì)BMSCs增殖的影響：以大鼠的BMSCs作為體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ停煌瑵舛華GEs（0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml）和相

2、應(yīng)濃度的BSA作用于BMSCs72小時(shí)，采用CCK-8法檢測(cè)BMSCs的增殖情況；觀察0.2mg/ml AGEs和BSA分別作用于細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)BMSCs增殖情況。
　　3. AGEs對(duì)BMSCs礦化的影響：
　　分組：（1）對(duì)照組（0.2mg/ml BSA+成骨誘導(dǎo)液）（2）實(shí)驗(yàn)組（0.2mg/ml AGEs+成骨誘導(dǎo)液）
　　方法：第3代BMSCs達(dá)到80％-90%融合時(shí)，0.25%胰酶消化，配制

3、1×104個(gè)/ml細(xì)胞混懸液。接種于6孔板中孵育。24小時(shí)后分別加入2mlBSA和AGEs液體。18天后行茜素紅染色。
　　4.觀察AGEs對(duì)LRP5mRNA、Col-ImRNA表達(dá)的影響：
　　分組：（1）成骨誘導(dǎo)液；（2）0.2mg/mlBSA+成骨誘導(dǎo)液；（3）0.2mg/mlAGEs+成骨誘導(dǎo)液；（4）50ug/ml抗RAGE中和性抗體+0.2mg/mlAGEs+成骨誘導(dǎo)液；
　　方法：上述濃度的藥物干預(yù)BMS

4、Cs7天，RT-PCR技術(shù)測(cè)定LRP5、Col-I mRNA的表達(dá)。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有數(shù)據(jù)均采用數(shù)據(jù)軟件包SPSS20.0進(jìn)行處理。計(jì)量資料以x?s表示，組內(nèi)比較采用配對(duì) t檢驗(yàn)。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間多重比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.原代 BMSCs集落樣貼壁生長(zhǎng)，鏡下觀察長(zhǎng)梭形、巢狀，傳代后細(xì)胞變短、多角。第三代BMSCs成骨分化誘導(dǎo)后進(jìn)行茜素紅

5、染色，在顯微鏡下觀察有鈣化結(jié)節(jié)形成。流式細(xì)胞儀進(jìn)行BMSCs表明標(biāo)志物鑒定，第三代BMSCs特異性表面標(biāo)志物CD44、CD90的陽性表達(dá)率分別為96.07%、99.34%，CD34的陰性表達(dá)率為0.19%。
　　2.在BMSCs培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的AGEs（0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml），72小時(shí)后， AGEs組較對(duì)照組BMSCs光密度（OD）值都有所降低，且

6、在0.05mg/ml～0.2mg/ml范圍內(nèi)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。觀察0.2mg/ml AGEs作用細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)BMSCs OD值的變化，發(fā)現(xiàn)AGEs組較BSA組在48小時(shí)、72小時(shí)BMSCs的增殖明顯抑制，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。AGEs對(duì)于BMSCs的抑制率隨著濃度的增大與時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高。
　　3. AGEs組作用于BMSCs18天后較對(duì)照組礦化結(jié)節(jié)的形成數(shù)量明顯減少。
　

7、　4. AGEs組作用于BMSCs7天后較對(duì)照組Col-ImRNA、LRP5 mRNA表達(dá)量減少，組間對(duì)照差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。給予抗 RAGE中和性抗體后行AGEs干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Col-ImRNA、LRP5 mRNA表達(dá)量較對(duì)照組無明顯變化，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1. AGEs呈濃度與時(shí)間依賴性抑制大鼠BMSCs的增值。
　　2. AGEs與受體RAGE結(jié)合后，抑制大鼠BMSCs