補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復(fù)機(jī)制影響的比較研究.pdf

1、腎藏精，主生殖；肝藏血，主疏泄?；谝韵氯矫妫阂皇恰案文I同源理論”：腎藏精，肝藏血，血的化生有賴于腎中精氣的氣化；腎中精氣的充盛，亦有賴于血的滋養(yǎng)。二是腎肝為母子之臟，母病可累及子病，子病可累及母病，臨床對(duì)于婦科疾病的治療，每每以腎為先，肝腎并治。三是中醫(yī)腎、肝與月經(jīng)周期的關(guān)系：腎氣的開闔藏瀉決定著沖任血海的充盈溢泄，從而形成月經(jīng)周期。肝主疏泄，與腎主封藏之間，存在著相互制約、相反相成的關(guān)系。肝疏泄功能正常，女子定期才有月經(jīng)的排泄。因

2、此，腎肝與月經(jīng)不調(diào)關(guān)系密切。月經(jīng)先后不定期、經(jīng)量過多、經(jīng)期延長(zhǎng)、崩漏等月經(jīng)不調(diào)以及由此導(dǎo)致的不孕癥皆與子宮內(nèi)膜修復(fù)異常有關(guān)系。臨床從腎肝辨治月經(jīng)失調(diào)取得了明顯的療效。
　　1984年FinnCA等用人工刺激子宮蛻膜化后撤退孕酮，使得小鼠子宮發(fā)生月經(jīng)樣改變，建立了第一個(gè)小鼠月經(jīng)模型，對(duì)研究子宮內(nèi)膜的變化建立了平臺(tái)。我們前期預(yù)試驗(yàn)利用激素序貫法復(fù)制小鼠月經(jīng)模型，并觀察了激素撤退后0h、8h、12h、16h、24h、32h、40h、48

3、h、72h的小鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)周期變化，結(jié)果顯示小鼠子宮內(nèi)膜變化均有人類增殖期、分泌期、崩解及修復(fù)的特征。12-16小時(shí)子宮內(nèi)膜開始崩解，24h出血強(qiáng)度最大且伴隨著子宮內(nèi)膜的初始修復(fù)，72h子宮內(nèi)膜完全修復(fù)。為進(jìn)一步探究腎肝對(duì)子宮內(nèi)膜修復(fù)的影響機(jī)制，我們選取24h、32h、40h、48h、72h為觀察點(diǎn)，比較了補(bǔ)腎方、調(diào)肝方、補(bǔ)腎調(diào)肝方（補(bǔ)腎方+調(diào)肝方）三方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復(fù)的影響。
　　第一部分補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)

4、模型子宮內(nèi)膜修復(fù)形態(tài)學(xué)的影響
　　目的：觀察比較補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜修復(fù)形態(tài)學(xué)的影響。
　　方法：C57BL/6J雌性小鼠7-8周齡200只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對(duì)照組，補(bǔ)腎組，調(diào)肝組、補(bǔ)腎調(diào)肝組（補(bǔ)腎方+調(diào)肝方組），每組50只。復(fù)制小鼠月經(jīng)模型：行雙側(cè)卵巢切除術(shù)后恢復(fù)1周，在第1-3d皮下注射100ng雌二醇（E2）；第7d將孕酮（P）皮埋管埋植于小鼠背部皮下，同時(shí)皮下注射50ngP和5ng E2；第8

5、-9d，繼續(xù)皮下注射5ng E2；在第9d的11：30，將15μl過濾除菌的花生油注射到小鼠右側(cè)子宮角以誘導(dǎo)蛻膜化，未注射花生油的一側(cè)子宮角作為對(duì)照，同時(shí)記錄每只小鼠花生油注射的時(shí)間。
　　蛻膜化誘導(dǎo)49h后，取出孕酮皮埋管（將此時(shí)間點(diǎn)作為孕酮撤退的0h）。各實(shí)驗(yàn)組在第10d分別給予補(bǔ)腎方、調(diào)肝方、補(bǔ)腎調(diào)肝方0.4ml灌胃，對(duì)照組用等容積蒸餾水，至第14d結(jié)束。在24h、32h、40h、48h、72h處死小鼠，取血，檢測(cè)各組血清E

6、2水平，取下子宮角，拍照，組織切片進(jìn)行觀察并評(píng)分。
　　結(jié)果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h血清E2水平的比較
　　1.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)血清E2水平
　　對(duì)照組血清E2水平，24h、32h均高于48h（P＜0.05），而48h高于72h（P＜0.05）。補(bǔ)腎組呈逐漸升高趨勢(shì)，48h、72h均高于24h（P＜0.05）。調(diào)肝組24h分別高于32h、40h（P＜0.05）。補(bǔ)腎調(diào)

7、肝組32h達(dá)高峰（P＜0.05）。
　　1.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間血清E2水平比較
　　與對(duì)照組比較，24h、40h，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組、補(bǔ)腎調(diào)肝組血清 E2水平均顯著降低（P＜0.05）。32h，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組顯著降低（P＜0.05），而補(bǔ)腎調(diào)肝組顯著升高（P＜0.05）；各實(shí)驗(yàn)組比較，24h，補(bǔ)腎組最低（P＜0.05）；在32h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、

8、72h子宮內(nèi)膜修復(fù)形態(tài)學(xué)評(píng)分比較
　　2.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜修復(fù)形態(tài)學(xué)評(píng)分
　　各組子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)評(píng)分均于48h、72h達(dá)到最高（P＜0.05）。
　　2.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間子宮內(nèi)膜修復(fù)形態(tài)學(xué)評(píng)分比較
　　隨時(shí)間的延長(zhǎng)，補(bǔ)腎組子宮內(nèi)膜形態(tài)學(xué)評(píng)分高于補(bǔ)腎調(diào)肝組，后者高于調(diào)肝組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而調(diào)肝組與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，E2水平高低對(duì)子宮內(nèi)

9、膜修復(fù)無明顯影響。補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎調(diào)肝方均能促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)，補(bǔ)腎方優(yōu)于補(bǔ)腎調(diào)肝方。調(diào)肝方對(duì)子宮內(nèi)膜修復(fù)無明顯影響。
　　第二部分補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜CXCL2、Bcl-2影響的比較
　　目的：探討補(bǔ)腎方、調(diào)肝方、補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜CXCL2、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，以比較三方影響子宮內(nèi)膜修復(fù)的機(jī)制。
　　方法：動(dòng)物分組及取材同第一部分。子宮角一部分取出浸入4％多聚甲醛固定，剩余部分凍存液氮，

10、然后-80℃放置備測(cè)。分別采用免疫組化SP法和Western blot檢測(cè)CXCL2、Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白的表達(dá)
　　1.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白的表達(dá)
　　在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h，各組子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白表達(dá)均于32h、48h達(dá)高峰（P＜0.05）。
　　1.

11、2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間CXCL2蛋白表達(dá)的比較
　　與對(duì)照組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組和補(bǔ)腎調(diào)肝組子宮內(nèi)膜CXCL2蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；各實(shí)驗(yàn)組比較，24h、48h、72h，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組、補(bǔ)腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05），補(bǔ)腎調(diào)肝組32h最低，40h最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白的表達(dá)
　　2.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)

12、子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白的表達(dá)
　　各組Bcl-2蛋白表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)高峰（P＜0.05）。
　　2.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間Bcl-2蛋白表達(dá)的比較
　　與對(duì)照組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組和補(bǔ)腎調(diào)肝組子宮內(nèi)膜Bcl-2蛋白表達(dá)均升高；各實(shí)驗(yàn)組比較，24h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。32h，調(diào)肝組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。40h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。48h，補(bǔ)

13、腎組、調(diào)肝組、補(bǔ)腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。72h，補(bǔ)腎組最高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜內(nèi)膜修復(fù)影響的作用機(jī)制相似，二者均能通過上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜CXCL2和Bcl-2的蛋白表達(dá)，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)因子方面影響子宮內(nèi)膜修復(fù)，尤以補(bǔ)腎方更為明顯?？赡芘c其不僅能增加CXCL2、Bcl-2蛋白的表達(dá)，且能維持較長(zhǎng)時(shí)間有關(guān)。調(diào)肝方雖能上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜CXCL2和Bcl-2蛋白表達(dá)，但未能加快

14、子宮內(nèi)膜修復(fù)。
　　第三部分補(bǔ)腎、調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜 VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達(dá)影響的比較
　　目的：探討補(bǔ)腎方、調(diào)肝方、補(bǔ)腎調(diào)肝方對(duì)小鼠月經(jīng)模型子宮內(nèi)膜VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達(dá)的影響，以比較三方影響子宮內(nèi)膜修復(fù)的機(jī)制。
　　方法：動(dòng)物分組及取材同第二部分。分別采用免疫組化 SP法檢測(cè)VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白的表達(dá)，Western blot檢測(cè) VEGF、Ang

15、-2蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜 VEGF蛋白的表達(dá)
　　1.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜VEGF蛋白的表達(dá)
　　各組VEGF蛋白表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)高峰（P＜0.05）。
　　.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間子宮內(nèi)膜VEGF蛋白表達(dá)的比較
　　與對(duì)照組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜 VEGF蛋白表達(dá)均升高；各實(shí)驗(yàn)組比較，24

16、h，調(diào)肝組、補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎調(diào)肝組是顯著降低（P＜0.05）。32h，調(diào)肝組最低（P＜0.05）。40h，補(bǔ)腎調(diào)肝組、調(diào)肝組、補(bǔ)腎組依次顯著降低（P＜0.05）。48h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。72h，補(bǔ)腎組最高（P＜0.05）。
　　2各組小鼠在孕酮撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白的表達(dá)
　　2.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白的表達(dá)
　　對(duì)照組 Ang-2蛋白表達(dá)呈先升

17、高后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)高峰（P＜0.05）。
　　2.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間Ang-2蛋白表達(dá)的比較
　　與對(duì)照組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜Ang-2蛋白表達(dá)均升高；各實(shí)驗(yàn)組比較，24h，調(diào)肝組最高（P＜0.05）。32h，補(bǔ)腎組、補(bǔ)腎調(diào)肝組、調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。40h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最高（P＜0.05）。48h、72h，補(bǔ)腎組、調(diào)肝組、補(bǔ)腎調(diào)肝組依次顯著降低（P＜0.05）。
　　3各組小鼠在孕酮

18、撤退后24h、32h、40h、48h、72h子宮內(nèi)膜 VEGFR2蛋白的表達(dá)
　　3.1同一組不同時(shí)間點(diǎn)子宮內(nèi)膜VEGFR2蛋白的表達(dá)
　　各組VEGFR2蛋白表達(dá)呈先升高后降低的趨勢(shì)，48h達(dá)高峰。（P＜0.05）。
　　3.2同一時(shí)間點(diǎn)不同組間VEGFR2蛋白表達(dá)的比較
　　與對(duì)照組比較，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，各實(shí)驗(yàn)組子宮內(nèi)膜 VEGFR2蛋白表達(dá)均升高；各實(shí)驗(yàn)組比較，24h，調(diào)肝組最高（P＜0.05），而32h，調(diào)肝

19、組最低（P＜0.05）。40h，補(bǔ)腎組最低（P＜0.05）。48h，補(bǔ)腎調(diào)肝組最低（P＜0.05）。72h，補(bǔ)腎組最高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：補(bǔ)腎方、補(bǔ)腎調(diào)肝方均能通過上調(diào)子宮內(nèi)膜 VEGF、Ang-2、VEGFR2蛋白表達(dá)，加快子宮內(nèi)膜修復(fù)。其作用機(jī)制可能是二方通過上調(diào)小鼠子宮內(nèi)膜VEGF進(jìn)一步影響CXCL2、Bcl-2、Ang-2、VEGFR2蛋白表達(dá)加快了子宮內(nèi)膜修復(fù)。補(bǔ)腎方對(duì)于子宮內(nèi)膜修復(fù)優(yōu)于補(bǔ)腎調(diào)肝方，其作用機(jī)制可