非基因重編程及生物模擬誘導促進ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞.pdf

1、第一部分 ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細胞球注射移植的影響
　　目的：3D球形培養(yǎng)和ROCK抑制劑對提高細胞活力，促進細胞增殖有很好的作用，本研究的目的是探索ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細胞（B-CECs）在體外的生長，可注射移植，以及球形3D培養(yǎng)的影響。
　　方法：采用胰酶消化法從屠宰場獲得的牛眼球中分離得到原代角膜內(nèi)皮細胞（B-CEC），采用多細胞微球具模型進行 B-CEC的球形培養(yǎng)并利用細胞死活染色、EdU染色和CCK-8

2、檢測評估ROCK抑制劑對B-CEC球與B-CECs增殖和活性的影響。利用體外可注射移植實驗分析ROCK抑制劑對B-CEC球在細胞培養(yǎng)板和仿生脫細胞角膜貼壁能力的影響，倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞形態(tài)。結(jié)果：免疫熒光染色表明Y-23672不改變CECs的表型，但通過細胞死活染色實驗、EdU染色實驗和CCK-8增殖實驗發(fā)現(xiàn)Y-23672可以顯著提高B-CECs與B-CEC球細胞的活性和增殖。采用多細胞微球具模型形成大小均勻的B-CEC球比單

3、散CECs有更高分化潛能。體外模擬移植可注射性實驗顯示，經(jīng)Y-23672處理的成球一天移植到細胞板或脫細胞角膜貼壁5天的B-CEC球可以貼壁完全并成鋪路石樣的單層細胞，而無Y-23672處理的對照組B-CEC球接種后仍有細胞聚集。
　　結(jié)論：與2D培養(yǎng)相比較，3D培養(yǎng)法能使B-CEC球有更高的分化潛能；ROCK抑制劑可以提升球形培養(yǎng)B-CEC的活力，促進球形培養(yǎng)的B-CEC的增殖、遷移，且不改變B-CEC固有的基因和蛋白的表達；我

4、們的研究結(jié)果表明3D瓊脂糖球形培養(yǎng)法結(jié)合ROCK抑制劑是形成含有角膜內(nèi)皮前體細胞和體外模擬移植可注射性B-CEC球?qū)槲磥鞢EC的治療有重要的應用意義。
　　第二部分非基因重編程及生物模擬誘導促進ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細胞
　　目的：探索重組蛋白和小分子在模擬微重力條件下對促進脂肪干細胞(ADSC)重編程成為角膜內(nèi)皮（CEC）樣細胞的影響，目標是要了解重組蛋白質(zhì)，小分子和仿生環(huán)境的組合能否為促進脂肪干細胞轉(zhuǎn)分化成為角膜

5、內(nèi)皮樣細胞建立起非基因直接重編程平臺系統(tǒng)。
　　方法：使用膠原酶消化法分離原代ADSC，并對細胞進行表型的鑒定。利用帶有穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2（PTD-OKS）以及小分子（Purmorphamine，RG108等重編程化合物）在模擬微重力反應器（SMG）中進行ADSC的重編程誘導。重編程后的ADSC在插入式共培養(yǎng)系統(tǒng)與絲裂霉素C處理的CEC以及角膜緣基質(zhì)細胞共培養(yǎng)并接種到脫細胞牛

6、角膜基質(zhì)進一步培養(yǎng)，RT-PCR和免疫熒光鑒定直接重編程后細胞的基因、蛋白表達情況。
　　結(jié)果：通過流式細胞術，成脂成骨分化法鑒定ADSC。使用帶穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2（PTD-OKS）以及小分子（Purmorphamine，RG108等重編程化合物）在模擬微重力反應器（SMG）中誘導后，RT-PCR和免疫熒光分析表明ADSCs陽性表達Nanog和CD34。共培養(yǎng)后的ADSC接種

7、到脫細胞角膜上成熟后，細胞形態(tài)由紡錘樣變?yōu)槎嘟切?；免疫熒光顯示直接重編程后的ADSCs弱陽性表達CD31、AQP-1、ZO-1。
　　結(jié)論：ADSC經(jīng)過重組蛋白與小分子在模擬微重力條件下重編程誘導后，具有更高的分化潛能；與CEC以及角膜基質(zhì)細胞共培養(yǎng)分化后接種到脫細胞角膜上呈現(xiàn)鋪路石樣六角形細胞形態(tài)，且陽性表達角膜內(nèi)皮標志物CD31、AQP-1、ZO-1。這些發(fā)現(xiàn)初步實現(xiàn)了ADSC直接重編程為CEC。我們的研究也首次表明SMG旋轉(zhuǎn)