湖南地區(qū)肝豆?fàn)詈俗冃曰蛲蛔儫狳c和多重PCR反向雜交技術(shù)研究.pdf

1、目的： 建立直接測定肝豆?fàn)詈俗冃?Hepatolenticular degeneration，HID；Wilson’s disease，WD)基因(ATP7B)全部外顯子序列的方法；測定湖南地區(qū)WD患者ATP7B基因外顯子、外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)序列，了解湖南地區(qū)wD基因突變類型，掌握湖南地區(qū)WD基因突變的規(guī)律和突變熱點；建立多重PCR反向雜交技術(shù)檢測wD基因突變的方法，初步探討多重PCR反向雜交技術(shù)檢測WD基因突變熱點的可行性、

2、敏感性和特異性。 方法： 1.ATP7B基因外顯子突變熱點的檢測與分析：抽取32例wD患者外周血，酚氯仿法提取DNA，針對ATP7B基因21個外顯子設(shè)計引物，PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下割取目的條帶，純化回收PCR產(chǎn)物，對PCR產(chǎn)物測序，進(jìn)行BLAST分析，得到ATP7B基因突變位點。 2.多重PCR反向雜交技術(shù)快速檢測ATP7B基因突變：針對ATP7B基因第8及12外顯子R778L、A952K突變熱點

3、設(shè)計兩組共四條檢測探針G2333(R778)、G2855(A952)、T2333(L778)、A2855(K952)，并將探針固定于尼龍膜。設(shè)計突變熱點所在的第8及12外顯子引物并以生物素標(biāo)記，多重PCR擴增后，將擴增產(chǎn)物與固定于尼龍膜的探針雜交。用鏈親合素.堿性磷酸酶結(jié)合蛋白與生物素結(jié)合，經(jīng)過染色觀察結(jié)果。研究多重PCR反向雜交技術(shù)檢測ATP7B基因突變可行性。 3.將多重PCR反向雜交技術(shù)檢測的結(jié)果與直接測序的結(jié)果進(jìn)行比較，

4、計算其特異性和敏感性。 結(jié)果： 1.根據(jù)自行設(shè)計的引物和實驗條件，成功地建立了擴增所有WD基因21個外顯子、外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)的方法。擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期的結(jié)果相同，直接測序結(jié)果與基因庫參照序列一致，證明引物設(shè)計正確，實驗條件適當(dāng)，實驗可靠。 2.檢查32例WD患者ATP7B基因外顯子，29例存在ATP7B基因外顯子致病突變或多態(tài)，占90.63％，其中21例存在致病突變，占65.63％；在突變患者中，復(fù)合雜合突變

5、17例，占53.13％；純合突變4例(均為hrg952Lys，多態(tài))，占12.50％。3例未見任何突變及多態(tài)，占9.37％。ATP7B基因外顯子突變以雜合突變?yōu)橹?，僅發(fā)現(xiàn)4例Arg952Lys純合突變，占12.50％。 3.共發(fā)現(xiàn)6種致病突變類型：①2號外顯子994G→T(Glu332Ter)突變，6.25％；②8號外顯子2333G→T(Arg778Leu)突變，突變頻率40.63％；③12號外顯子2828G→A(Gly943A

6、sp)突變，突變頻率3.13％；④13號外顯子2975C→T(Pr0992Leu)突變，突變頻率3.13％；⑤16號外顯子3532A→G(Thrll78Ala)突變，突變頻率6.25％；⑥18號外顯子3884C→T(Alal295Val)突變，突變頻率9.38％。其中994G→T，3532A→G，3884C→T 3種突變尚未見文獻(xiàn)報道，為新發(fā)現(xiàn)的突變。 共發(fā)現(xiàn)6種多態(tài)：①2號外顯子1122C→G(Val374Val)突變，突變頻

7、率3.13％；②2號外顯子1216T→G(Ser406Ala)突變，突變頻率6.25％；③3號外顯子1366G→C(Val456Leu)突變，突變頻率6.25％；④8號外顯子2310C→G(Leu770Leu)突變，突變頻率40.63％；⑤12號外顯子2855G→A(Arg952Lys)雜合突變，突變頻率18.75％；12號外顯子2855G→A(Arg952Lys)純合突變，突變頻率12.50％；⑥16號外顯子3419T→C(Valll

8、40Ala)突變，突變頻率6.25％。其中2號外顯子1122C→G突變尚未見文獻(xiàn)報道，為新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)。 外顯子1、4、5、6、7、9、10、11、15、17、19、20、21等未發(fā)現(xiàn)突變。 4.雖然進(jìn)行了全部外顯子直接測序，仍有3例患者未發(fā)現(xiàn)任何突變，9例患者僅發(fā)現(xiàn)多態(tài)而沒有致病突變。鑒于多例患者外顯子未發(fā)現(xiàn)突變或僅有一個雜合突變，強烈提示外顯子編碼區(qū)以外的突變有引起肝豆?fàn)詈俗冃钥赡堋?5.成功地建立了同時檢測A

9、TP7B基因8號外顯子Arg778Leu突變和和12號外顯子Arg952Lys突變的多重PCR反向雜交技術(shù)。固定于尼龍膜上的針對8號外顯子突變位點及12號外顯子多態(tài)位點的DNA探針與生物素標(biāo)記引物的多重PCR擴增產(chǎn)物雜交后，如存在突變則在突變位點探針點樣處可看到斑點顯示，如無突變則在正常序列探針處有斑點顯示。各種實驗對照未出現(xiàn)假陽性和假陰性。 6.用多重PCR反向雜交技術(shù)檢測32例WD患者，13例患者第8外顯子存在2333G→T

10、雜合突變，6例患者第12外顯子存在2855G-A雜合突變，4例存在2855G→A純合突變，未出現(xiàn)假陽性和假陰性，與直接序列測定方法比較，其特異性和敏感性均為100％。 結(jié)論： 1.根據(jù)自行設(shè)計的引物和實驗條件，成功地建立了肝豆?fàn)詈俗冃曰?1個外顯子擴增和測序方法。 2.在檢查的32例wD患者中，29例存在ATP7B基因外顯子致病突變或多態(tài)，占90.63％，其中21例存在致病突變，占65.63％；在突變患者中，復(fù)

11、合雜合突變17例，占53.13％；純合突變4例(均為Arg952Lys，多態(tài))，占12.50％。3例未見任何突變及多態(tài)，占9.37％。 3.共發(fā)現(xiàn)6種ATP7B基因突變：994G→T(G1u332Ter)，2333G→T(Arg778Leu)，2828G→A(Gly943Asp)，2975C→T(Pr0992Leu)，3532A→G(Thrll78Ala)，3884C→T(Alal295Val)，其中994G→T，3532A→G

12、，3884C→T突變尚未見文獻(xiàn)報道，為新發(fā)現(xiàn)的突變；發(fā)現(xiàn)6種多態(tài)，其中1122C→G突變尚未見文獻(xiàn)報道，為新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)。ATP7B基因外顯子突變以雜合突變?yōu)橹?，僅發(fā)現(xiàn)4例Arg952Lys純合突變，占12.50％。 4.湖南地區(qū)肝豆?fàn)詈俗冃曰蛲蛔円噪s合、點突變?yōu)橹?，分布較分散。8號外顯子Arg778Leu突變?yōu)楹系貐^(qū)突變熱點，占所檢查患者的40.63％，其次為18號外顯子Ala1295Val突變，占9.38％。 5.

13、鑒于多例患者外顯子未發(fā)現(xiàn)突變或僅有一個雜合突變，強烈提示外顯子以外的區(qū)域的突變有引起WD的可能。 6.成功地建立了同時檢測ATP7B基因8號外顯子Arg778Leu突變和和12號外顯子Arg952Lys突變的多重PCR反向雜交技術(shù)。 7.用多重PCR反向雜交技術(shù)檢測32例wD患者，與直接序列法測定的結(jié)果比較，特異性和敏感性均為100％。多重PCR反向雜交具有技術(shù)簡單、快捷、敏感性高、特異性強的特點，在找出某地區(qū)突變熱點的