液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法在體內(nèi)有毒動(dòng)植物成分檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、在我國(guó)民間,許多動(dòng)植物作為藥用和食用,有的甚至作為“滋補(bǔ)品”食用,這些動(dòng)植物往往含有毒性成分,甚至是劇毒成分,其治療量與中毒量接近,因用藥不當(dāng)、盲目和超量服用可造成中毒和死亡。在司法鑒定實(shí)踐中,由此導(dǎo)致的各類誤服、自殺、投毒、醫(yī)療糾紛等的案件時(shí)有發(fā)生。由于有毒動(dòng)植物所含成分復(fù)雜多樣、毒性大、含量低以及在人體內(nèi)代謝迅速、且中毒無(wú)特異性臨床表現(xiàn)等問題,使復(fù)雜生物體系中有毒動(dòng)植物成分的鑒定成為長(zhǎng)期以來(lái)未能有效解決的技術(shù)難題,對(duì)有毒動(dòng)植物中毒的

2、法醫(yī)學(xué)鑒定、臨床診治以及食品安全監(jiān)測(cè)缺乏有效的檢測(cè)手段和科學(xué)的評(píng)判依據(jù)。
　　 現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展使得復(fù)雜生物體系中有毒動(dòng)植物成分的檢測(cè)和中毒鑒定成為可能。近年來(lái),液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在法醫(yī)和臨床毒物分析領(lǐng)域的應(yīng)用得到迅速發(fā)展。具有液相色譜高效的在線分離能力和質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度的檢測(cè)能力的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法,可以同時(shí)得到化合物的保留時(shí)間、分子量以及特征結(jié)構(gòu)碎片等豐富的信息,尤其是串聯(lián)質(zhì)譜可從復(fù)雜基質(zhì)中確認(rèn)目標(biāo)物,采用選擇

3、離子監(jiān)測(cè)或多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,更可大大提高分析的專一性和靈敏度,完全有望解決復(fù)雜生物體系中痕量有毒動(dòng)植物成分的檢測(cè),并在分析目標(biāo)物不明確或系統(tǒng)中可能存在數(shù)種不同性質(zhì)的目標(biāo)物時(shí),用一個(gè)分析系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)多種不同性質(zhì)的目標(biāo)物。同時(shí)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析目標(biāo)物范圍廣,前處理簡(jiǎn)單,不需衍生化,體現(xiàn)出比氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法更靈敏、有效的檢測(cè)手段,從而對(duì)復(fù)雜生物體系中的有毒動(dòng)植物成分的鑒定和確認(rèn)提供科學(xué)依據(jù)。
　　 本課題以血液、尿液和組織為主

4、要生物檢材,研究、探索、建立了22種常見有毒生物堿成分系統(tǒng)篩選方法,烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿、秋水仙堿和河豚毒素的定性定量方法,并對(duì)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和秋水仙堿的定量分析方法進(jìn)行了全面、系統(tǒng)的方法有效性驗(yàn)證,解決了LC—MS/MS分析中的樣品處理、色譜分離及優(yōu)化、質(zhì)譜條件的選擇與優(yōu)化等關(guān)鍵技術(shù)問題,同時(shí)對(duì)它們?cè)诩毙灾卸倦嗍蟮捏w內(nèi)分布進(jìn)行探討,并成功地將所建方法應(yīng)用于司法鑒定實(shí)踐,為涉毒案件的審理提供了科學(xué)證據(jù)。
　　

5、具體研究?jī)?nèi)容如下:
　　 一、建立了基于LC—MS/MS—MRM技術(shù)的血液中22種有毒生物堿成分的篩選體系和確證方法。目標(biāo)物涵蓋了在實(shí)際檢案工作中常見的有毒生物堿。所建方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專一性強(qiáng),色譜分離采用兩根不同性能的色譜柱,使目標(biāo)物的分離、檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)所需時(shí)間等方面得到互補(bǔ),整個(gè)過程可在16min內(nèi)完成。最低檢測(cè)限除羥基喜樹堿稍高(20ng/mL)外,絕大多數(shù)的LOD足以滿足法醫(yī)毒物學(xué)和臨床藥物學(xué)中中毒或治療濃

6、度目標(biāo)物的檢測(cè)要求。
　　 二、烏頭生物堿的中毒、檢測(cè)及應(yīng)用
　　 1.建立了測(cè)定血液、尿液和組織中烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的LC—MS/MS—MRM分析方法,并對(duì)其定量方法進(jìn)行了全面系統(tǒng)的方法有效性驗(yàn)證,內(nèi)容包括考察方法的線性范圍、最低檢出限、精密度、回收率、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等,取得了滿意的結(jié)果。所建方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏,適用于體內(nèi)痕量烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的檢測(cè)。
　　 2.研究了烏頭堿在急性中

7、毒豚鼠的體液和組織中的分布。取豚鼠8只,以1.0-4.0mg/kg劑量灌胃給藥致豚鼠烏頭堿急性中毒,解剖后取體液和組織進(jìn)行烏頭堿測(cè)定。烏頭堿在體液和組織中的含量從大到小依次為:膽汁>血液>尿液>胃>肺>心>脾>腎>胰>肝。血液可作為烏頭堿中毒、死亡分析的首選生物檢材。
　　 3.將所建方法成功地應(yīng)用于鑒定實(shí)踐,對(duì)生物檢材中痕量烏頭生物堿的成分進(jìn)行定性定量分析,并對(duì)多起烏頭植物中毒尸體中體液和組織中的烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿的含

8、量進(jìn)行測(cè)定,首次報(bào)道了新烏頭堿和次烏頭堿在尸體組織中分布,為涉及烏頭中毒案件的死因判定和案件的審理提供了明確的方向和科學(xué)的證據(jù)。
　　 三、秋水仙堿的中毒、檢測(cè)及應(yīng)用
　　 1.建立了測(cè)定血液、尿液和組織中秋水仙堿的LC-MS/MS—MRM分析方法,并對(duì)其定量方法進(jìn)行了全面系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證,內(nèi)容包括方法的線性范圍、最低檢出限、精密度、回收率、準(zhǔn)確度、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等,所得結(jié)果符合法醫(yī)毒物分析的要求。所建方法簡(jiǎn)便、快速、

9、靈敏,最低檢出限可低至0.05ng/mL,能夠滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物分析的要求。
　　 2.研究了秋水仙堿在急性中毒豚鼠體內(nèi)的分布。取豚鼠5只,以4.0mg/kg劑量灌胃給藥致豚鼠秋水仙堿急性中毒,解剖后取體液和組織進(jìn)行秋水仙堿含量測(cè)定。秋水仙堿在體液和組織中的含量從大到小依次為:膽汁>尿液>脾>胃>肺>腎>心>胰>肝>腎上腺>睪丸,心血中秋水仙堿的含量最低。尿液可作為秋水仙堿分析的首選生物檢材。
　　 3.將所建方

10、法成功地應(yīng)用于鑒定實(shí)踐,對(duì)中毒尸體的生物檢材及野生植物中秋水仙堿的成分進(jìn)行定性定量分析,為涉及有毒植物中毒案件的死因判定提供了明確的方向和證據(jù)。
　　 四、生物檢材中河豚毒素的檢測(cè)及應(yīng)用。建立了測(cè)定血液、尿液和組織中河豚毒素的LC—MS/MS—MRM測(cè)定方法,考察了方法的線性范圍及最低檢出限。并將所建方法應(yīng)用于食用河豚魚中毒的實(shí)際案例中,取得了滿意的效果。
　　 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)及研究的意義如下:
　　 1.建立的

11、有毒生物堿成分篩選分析方法簡(jiǎn)便、靈敏,避免了生物檢材中該類物質(zhì)用傳統(tǒng)方法檢測(cè)可能出現(xiàn)的漏檢、錯(cuò)檢現(xiàn)象,整個(gè)分析可在16min內(nèi)完成。篩選目標(biāo)物涵蓋了司法鑒定中常見的有毒生物堿成分,且LC—MS/MS篩選體系可隨著目標(biāo)物的增加而不斷擴(kuò)充,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)更多的目標(biāo)物進(jìn)行篩選。該方法為首創(chuàng)方法。
　　 2.全面系統(tǒng)地闡述了生物檢材中定量方法的有效性驗(yàn)證,規(guī)范了方法的評(píng)價(jià)指標(biāo),通過對(duì)生物檢材中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿和秋水仙堿的檢測(cè)方法的

12、有效性驗(yàn)證,證明了所建方法準(zhǔn)確、靈敏、專屬、重現(xiàn)和可靠。
　　 3.建立了生物檢材中烏頭生物堿LC—MS/MS—MRM分析方法。首次報(bào)道了烏頭中毒尸體中與烏頭堿共存的新烏頭堿和次烏頭堿的體內(nèi)分布,為涉及有毒植物中毒案件的死因判定提供了明確的方向和證據(jù)。
　　 4.建立了生物檢材中秋水仙堿LC—MS/MS—MRM分析方法。所建方法足夠靈敏,最低檢出限可低至0.05ng/mL,能夠滿足法醫(yī)毒物分析和臨床毒物分析的要求。