自噬參與DEHP誘導(dǎo)新生鼠原始卵泡的異常發(fā)育.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸二乙基己酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）是一種聚氯乙烯材料增塑劑，因其與塑料基質(zhì)之間不形成共價鍵，而是以氫鍵和范德華力連接，故易從塑料中溶出而污染環(huán)境，對人類的健康造成影響。已有相關(guān)文獻報導(dǎo)，DEHP是一種環(huán)境類雌激素，一旦進入人體，可對人類身體健康造成多方面的影響。DEHP對女性生殖健康的影響已得到廣泛的關(guān)注?，F(xiàn)有研究表明，卵巢是 DEHP雌性毒性作用的主要靶器官。課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)，DEH

2、P可以誘導(dǎo)新生鼠原始卵泡的發(fā)育出現(xiàn)異?，F(xiàn)象，但其作用機制是如何產(chǎn)生的，并不清楚。自噬是真核細胞中普遍存在的生命現(xiàn)象，是將細胞內(nèi)變形、衰老或損傷的蛋白質(zhì)和細胞器轉(zhuǎn)運到溶酶體腔中消化降解的一種代謝過程，在維持細胞存活、更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著重要作用。因此，本文旨在研究自噬是否參與 DEHP誘導(dǎo)新生鼠原始卵泡發(fā)育異常這一過程。
　　方法：將健康6~8周齡清潔級成年雌性昆明鼠隨機分為對照組和DEHP組，每組30只。待成年雌鼠生

3、產(chǎn)后，采用腹腔注射方式，DEHP組按濃度×體重（g）/天（d），即0.62mg/kg/d、2.5mg/kg/d、5 mg/kg/d、10 mg/kg/d劑量對新生鼠進行腹腔注射,對照組注射相同體積玉米油，從新生鼠出生后第1天（1 day post-parturition，1 dpp）開始注射，每天1次，連續(xù)5天，注射結(jié)束后，第6天早上（6 dpp）收集新生鼠卵巢組織，進行以下實驗：①研究DEHP對卵泡發(fā)育的影響：HE染色觀察新生鼠卵巢卵

4、泡的發(fā)育情況；透射電鏡觀察 DEHP對新生鼠卵巢卵泡的影響；Real-time PCR檢測卵泡發(fā)育標(biāo)志分子即生長分化因子9（Growth Differentiation Factor9,GDF9）mRNA的變化情況。②研究DEHP對新生鼠卵巢自噬形成過程中標(biāo)志物的影響：Western blot檢測自噬小體標(biāo)志性蛋白LC3的表達情況；透射電鏡檢測自噬小體。③研究 DEHP對新生鼠卵巢自噬形成過程中關(guān)鍵蛋白的影響：Real-time PCR

5、檢測ULK1、Beclin1、Atg5的mRNA表達情況；Western blot檢測p-ULK1、Beclin1、Atg5的蛋白表達水平。④研究DEHP對新生鼠卵巢自噬形成的影響：Western blot檢測AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、p-P70s6k（T389）、p-4EBP1的蛋白表達情況；⑤研究DEHP對自噬降解的影響：Real-time PCR檢測 LAMP2、P62、Cathepsin B的mRNA表達情

6、況； Western blot檢測 LAMP2、P62、Cathepsin B、Cathepsin L的蛋白表達情況。⑥研究DEHP聯(lián)合自噬抑制劑3-MA干預(yù)后對新生鼠卵泡發(fā)育的影響：HE染色觀察卵泡發(fā)育情況，并對卵巢中的原始卵泡進行計數(shù)。
　　結(jié)果：采用DEHP處理新生鼠之后，結(jié)果顯示：?、HE染色結(jié)果顯示，與對照組比較，DEHP處理組新生鼠，原始卵泡數(shù)量明顯減少，且 DEHP濃度越高，原始卵泡數(shù)量減少得越明顯。?、透射電鏡下觀

7、察到采用 DEHP處理之后，卵細胞減小，透明帶絨毛膜不明顯，卵泡細胞數(shù)量減少，卵細胞發(fā)育遲緩。且采用低劑量0.62mg/kg濃度處理新生鼠之后，可在新生鼠卵巢組織中發(fā)現(xiàn)大量自噬小體的存在。?、Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，DEHP處理組自噬標(biāo)志性分子LC3蛋白的表達顯著增加，與自噬形成過程相關(guān)的蛋白Atg5、Beclin1、p-P70s6k（T389）、p-AMPK、p-mTOR的表達亦明顯增加；p-ULK1、p-4E

8、BP1表達明顯降低；同時與自噬降解關(guān)系密切的蛋白 LAMP2、Cathepsin L、Cathepsin B、P62表達亦顯著增加。Real-time PCR結(jié)果顯示Atg5、Beclin1、LAMP2、Cathepsin B、P62、ULK1的mRNA表達結(jié)果與蛋白表達結(jié)果一致。④、HE染色結(jié)果顯示DEHP聯(lián)合自噬抑制劑3-MA處理后其原始卵泡數(shù)量明顯增加。
　　結(jié)論：在 DEHP的作用下，新生鼠卵巢中的自噬小體增加，自噬形成過