2型糖尿病大鼠以及Toll樣受體4表達(dá)及辛伐他汀干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:2型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)是一種多基因遺傳的代謝性疾病，其慢性并發(fā)癥可廣泛累及心、肝、腎、視網(wǎng)膜、血管、神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌、皮膚等，其中糖尿病性心臟病嚴(yán)重威脅著糖尿病患者的生命。其發(fā)病機(jī)理尚未系統(tǒng)闡明，目前認(rèn)為與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗、血管壁功能障礙、微循環(huán)異常、心肌細(xì)胞膜功能改變、糖基化終產(chǎn)物等因素密切相關(guān)。近年來，炎癥和免疫學(xué)說日益引起了人們的關(guān)注。Toll樣受體4(

2、Toll-likereceptor4，TLR4)是介導(dǎo)炎癥和免疫反應(yīng)的主體，可識(shí)別多種外源性配體，同時(shí)也能識(shí)別與炎癥、應(yīng)激、機(jī)體損傷等相關(guān)的內(nèi)源性配體，其與配體結(jié)合后可激活髓樣分化蛋白88依賴性和髓樣分化蛋白88非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致一系列的炎癥和免疫反應(yīng)的發(fā)生。TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)有重要的調(diào)控作用，因此可將TLR4作為炎癥和自身免疫性疾病的治療靶點(diǎn)。辛伐他汀屬于HMG-CoA還原酶抑制劑，除了調(diào)脂

3、作用外，還可改善內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗炎、穩(wěn)定斑塊、抗血栓、抗細(xì)胞凋亡等，在免疫、炎癥性疾病中具有廣大的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)制備T2DM大鼠模型，檢測(cè)各組大鼠心臟中TLR4的表達(dá)情況，以探討TLR4與T2DM心臟病變的關(guān)系及辛伐他汀對(duì)糖尿病性心臟病的影響及其機(jī)制。
　　 方法:40只雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠，鼠齡6周，體重為180g±20g。清潔實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下予普通飼料喂養(yǎng)1周，后應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法從40只大鼠中隨機(jī)

4、抽取10只作為正常對(duì)照組（A組），其余為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組用高糖高脂飼料（普通飼料中加入20％白砂糖、2.5％膽固醇、15％熟豬油）喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素30mg/kg。實(shí)驗(yàn)第6周末選取空腹血糖(fastingbloodglucose，F(xiàn)BG)大于等于7.8mmol/L（正常大鼠空腹血糖3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）且伴有胰島素敏感指數(shù)(insulinsensitivityindex，ISI)

5、降低者作為2型糖尿病大鼠模型，共26只，將其隨機(jī)分為兩組:單純2型糖尿病組（B組，13只）、辛伐他汀干預(yù)組（C組，13只）。辛伐他汀組予20mg/kg辛伐他汀灌胃，每日給藥1次，連續(xù)灌胃8周，對(duì)照組、單純糖尿病組均予等體積生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)第14周末:1.心臟取血2mL待測(cè)FBG、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(lowdensitylipoprotein

6、cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C)、肌酸激酶(creatinekinase，CK)等生化指標(biāo)。2.取部分心臟置于液氮中保存，采用RT-PCR法檢測(cè)TLR4mRNA的表達(dá)水平，且應(yīng)用ImageJ凝膠圖像分析處理系統(tǒng)計(jì)算目的片斷TLR4/β-actin條帶的OD比值;另取部分心臟予4％多聚甲醛固定，待HE染色觀察心臟形態(tài)學(xué)變化，免疫組織化

7、學(xué)染色檢測(cè)TLR4的蛋白表達(dá)，且應(yīng)用Image-ProPlus6.0圖像分析軟件計(jì)算其IOD/Area。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，偏態(tài)分布以中位數(shù)、四分位數(shù)間距表示。正態(tài)分布、方差齊，兩組比較采用成組t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間比較應(yīng)用SNK檢驗(yàn);偏態(tài)分布，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，多組比較采用多個(gè)獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)，均以P

8、＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、實(shí)驗(yàn)第6周末實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
　　 實(shí)驗(yàn)組FBG為11.98±1.97mmol/L明顯高于對(duì)照組的5.85±1.11mmol/L（P＜0.05）;實(shí)驗(yàn)組FINS為17.90(3.63)mIU/L，與對(duì)照組17.00(5.14)mIU/L比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;實(shí)驗(yàn)組ISI為0.0051(0.0018)低于對(duì)照組的0.0110(0.0051)，差異有統(tǒng)

9、計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。(Table1，F(xiàn)ig.1-3)
　　 2、實(shí)驗(yàn)第14周末各組大鼠生化指標(biāo)比較
　　 2.1、血糖
　　 單純糖尿病組的FBG為12.04±2.04mmol/L，辛伐他汀組的FBG為11.23±2.61mmol/L，均明顯高于對(duì)照組的5.92±1.28mmol/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;而前兩組之間的FBG無明顯差異（P＞0.05）。(Table2，F(xiàn)ig.4)
　　

10、 2.2、血脂
　　 對(duì)照組:TG0.80±0.21mmol/L、TC2.47±0.59mmol/L、LDL-C1.21±0.29mmol/L、HDL-C1.87±0.33mmol/L
　　 單純糖尿病組:TG1.86±0.22mmol/L、TC5.15±1.09mmol/L、LDL-C2.13±0.17mmol/L、HDL-C0.67±0.17mmol/L
　　 辛伐他汀組:TG1.13±0.27mmol/L

11、、TC3.30±0.91mmol/L、LDL-C1.67±0.33mmol/L、HDL-C1.27±0.30mmol/L
　　 結(jié)果顯示單純糖尿病組、辛伐他汀組的TG、TC、LDL-C水平均明顯高于對(duì)照組，辛伐他汀組的TG、TC、LDL-C水平低于單純糖尿病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;三組大鼠的HDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。(Table2，F(xiàn)ig.5)
　　 2.3、心肌酶
　　 對(duì)照組

12、的CK為952(623)U/L，單純糖尿病組的CK為1307(1430)U/L，辛伐他汀組的CK為1375(741)U/L，三組之間無明顯差異（P＞0.05）。(Table3，F(xiàn)ig.6)
　　 3、心臟HE染色
　　 對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，胞核似橢圓形或長方形，胞質(zhì)清晰，偶見炎細(xì)胞。單純糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞明顯水腫、變性、壞死，可見廣泛性心肌纖維斷裂、壞死，間質(zhì)充血，并可見大量炎細(xì)胞浸

13、潤。辛伐他汀組大鼠的心肌細(xì)胞水腫、變性，心肌纖維斷裂，間質(zhì)充血，炎細(xì)胞浸潤等情況較單純T2DM組明顯減輕。(Fig.7-9)
　　 4、心臟TLR4蛋白表達(dá)水平
　　 心臟TLR4蛋白表達(dá)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的棕黃色顆粒沉著。對(duì)照組大鼠心臟有少量表達(dá)，呈淺棕黃色;單純糖尿病組大鼠心臟TLR4的蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組，呈棕黃色;辛伐他汀組大鼠心臟TLR4的表達(dá)較單純糖尿病組明顯減少，但仍多于對(duì)照組。免疫組織化學(xué)染色圖像

14、分析結(jié)果示對(duì)照組的IOD/Area為0.3210±0.0151;單純糖尿病組的IOD/Area為0.6157±0.0233，是對(duì)照組的1.92倍;辛伐他汀組的IOD/Area為0.4302±0.0224，是單純糖尿病組的69.87％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(Table4，F(xiàn)ig.10-12)
　　 5、心臟TLR4mRNA表達(dá)水平
　　 心臟TLR4mRNA的表達(dá)結(jié)果以rTLR4表示（rTLR4=TLR4

15、0D值/β-actinOD值）。對(duì)照組大鼠心臟TLR4mRNA表達(dá)較弱，rTLR4為0.42±0.06;單純糖尿病組大鼠心臟rTLR4為1.43±0.16，是對(duì)照組的3.41倍;辛伐他汀組rTLR4為0.73±0.13，是單純糖尿病組的51.05％，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。(Table5，F(xiàn)ig.13)
　　 結(jié)論:
　　 1、單純T2DM組TLR4的蛋白和mRNA表達(dá)水平明顯升高，說明TLR4可能參與了T