強(qiáng)制泛素化HBcAg重組慢病毒誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)抑制HBV復(fù)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：采用四質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得高滴度的攜帶強(qiáng)制泛素化HBcAg（Ub-HBcAg）融合基因的重組慢病毒顆粒，探討重組慢病毒LV-Ub-HBcAg在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)HBV特異性體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)的效果，比較LV-Ub-HBcAg體外修飾的DC免疫和直接免疫兩種免疫方式的效果，并進(jìn)一步探討LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)特異性體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)病毒復(fù)制的抑制作用。
　　方法：1.應(yīng)用PCR從質(zhì)粒pcDNA3.1(

2、-)-Ub-HBcAg中擴(kuò)增Ub-HBcAg融合基因，插入至慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pLOV.UBC.EGFP.3FLAG中，構(gòu)建重組表達(dá)載體質(zhì)粒pLOV.UBC.Ub-HBcAg.EGFP.3FLAG。使用脂質(zhì)體將構(gòu)建完成的重組表達(dá)載體質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒pLP1、pLP2以及包膜質(zhì)粒pLP/VSVG共轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞進(jìn)行包裝，得到攜帶Ub-HBcAg融合基因的重組慢病毒顆粒LV-Ub-HBcAg，純化及Western blot鑒定。2.將

3、BALB/c小鼠隨機(jī)分為L(zhǎng)V-Ub-HBcAg/DC、LV-HBcAg/DC、LV/DC、LV-Ub-HBcAg、LV-HBcAg、LV、DC及PBS組，經(jīng)小鼠后足墊皮下免疫小鼠，每2周一次，共2次。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清HBcAb滴度水平及T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4及IL-10的水平；CCK-8法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖活性；流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法檢

4、測(cè)分泌IFN-γ的特異性T淋巴細(xì)胞；LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性CTL殺傷活性。3.將HBV轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組LV-Ub-HBcAg，對(duì)照組LV-HBcAg、HBcAg、IFN-α、LV及PBS組，經(jīng)小鼠后足墊皮下免疫小鼠，每2周一次，共2次。ELISA法檢測(cè)血清HBcAb滴度；微粒子酶免疫分析法（MEIA）檢測(cè)血清HBsAg水平；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)HBV DNA水平；免疫生化檢測(cè)血清AST、ALT水平；ELISA法

5、檢測(cè)T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、TNF-α、IL-4及IL-10水平；流式細(xì)胞儀檢測(cè)T淋巴細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞因子；酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)（ELISPOT）法檢測(cè)分泌IFN-γ的特異性T淋巴細(xì)胞；LDH釋放試驗(yàn)檢測(cè)特異性CTL活性；HE染色檢測(cè)肝臟組織學(xué)及免疫組織化學(xué)檢測(cè)HBsAg、HBcAg的表達(dá)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)T淋巴細(xì)胞內(nèi)T-bet及GATA-3水平。
　　結(jié)果：1.強(qiáng)制泛素化HBcAg融合基

6、因的重組慢病毒表達(dá)載體經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)了所攜帶目的基因的序列及插入方向正確，重組慢病毒LV-Ub-HBcAg轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后通過(guò)Western blot檢測(cè)到目的基因的蛋白表達(dá)。2. LV-Ub-HBcAg、LV-Ub-HBcAg/DC均可誘導(dǎo)BALB/c小鼠體內(nèi)特異性體液及細(xì)胞免疫反應(yīng)，兩組均能有效升高小鼠血清中HBcAb的IgG水平，其中以IgG2α亞型水平增高為主，IgG1亞型無(wú)明顯增高；兩組均可刺激小鼠T淋巴細(xì)胞增殖和特異性CT

7、L殺傷活性，分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2；流式細(xì)胞儀及ELISPOT法檢測(cè)兩組誘導(dǎo)的CTL水平明顯高于其他組；兩組之間免疫效果比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. LV-Ub-HBcAg能有效升高HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清中IgG2α為主的HBcAb水平，促進(jìn)分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及TNF-α；LV-Ub-HBcAg誘導(dǎo)的特異性CTL水平明顯高于其他組；肝組織HE染色顯示LV-Ub-HBcAg組炎性細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，免

8、疫組化顯示HBsAg、HBcAg表達(dá)明顯減少，降低小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平，升高血清中AST、ALT水平，LV-Ub-HBcAg可上調(diào)T-bet的表達(dá)并且下調(diào)GATA-3的表達(dá)。
　　結(jié)論：構(gòu)建、包裝及純化了攜帶強(qiáng)制泛素化HBcAg融合基因的重組慢病毒LV-Ub-HBcAg，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可檢測(cè)到目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。重組慢病毒LV-Ub-HBcAg體外修飾的DC免疫和直接免疫兩種免疫方式免疫BALB/c小鼠后，