機械牽伸對大鼠TSCs MGF表達的影響及其對TSCs分化增殖的調(diào)控作用.pdf

1、肌腱病(Tendinopathy)是一種常見的多種因素引起的肌腱功能障礙的綜合征，其治療方式多樣，但總體治療效果有限，究其原因在于肌腱病的發(fā)病機制尚未完全闡明[1-3]。肌腱干細胞(tendon stem cells，TSCs)作為肌腱來源的特殊干細胞在維持肌腱正常生理功能及肌腱病病理生理過程中都扮演重要角色。如何調(diào)控TSCs正常分化為肌腱細胞修復肌腱微損傷，對于提高肌腱病的防治水平具有重要意義。目前已研究證實TSCs可受多種因素調(diào)控，

2、如機械應力、炎癥因子、皮質(zhì)醇激素、細胞因子等。在眾多調(diào)控因素中，機械應力是肌腱病發(fā)病始動因素，對于TSCs調(diào)控作用重要性不言而喻。
　　力生長因子(Mechano growth factor，MGF)，也稱為機械生長因子，廣泛存在于骨、骨骼肌、肌腱、腦等組織，是在受到機械應力、電刺激或者組織損傷時產(chǎn)生的一種胰島素樣生長因子-1的選擇性剪接異構體。自從MGF被發(fā)現(xiàn)以來，其獨特的E肽結構及其特有的功能吸引著眾多學者的關注，現(xiàn)已證實MG

3、F對多種細胞的增殖、遷移及分化有重要作用。另外有研究發(fā)現(xiàn)肌腱組織經(jīng)機械應力刺激后，MGF表達會顯著升高，且反應時間明顯早于IGF-1。然而，TSCs作為肌腱病發(fā)病過程中的“明星細胞”，在受到機械牽伸應力作用后MGF表達水平如何變化以及MGF對其增殖分化及遷移能力是否起到一定的調(diào)節(jié)作用卻未見相關報道。同時，機械牽伸和MGF對于TSCs的分化調(diào)控是單獨作用還是共同作用？是相互協(xié)同作用還是拮抗作用呢？這一系列問題均亟待解決。
　　目的：

4、本課題研究目的主要是:1.驗證機械牽伸對TSCs分化的調(diào)控及對MGF表達的影響;2.明確MGF對TSCs增殖、分化、遷移的影響及調(diào)控機制;3.闡明MGF在機械牽伸條件下對TSCs分化調(diào)控的影響及其機制。
　　方法：
　　第一部分:進行大鼠TSCs分離培養(yǎng)鑒定;通過Real-time PCR、Western Blot分別從轉錄和翻譯水平檢測不同機械牽伸條件處理后TSCs中成骨、成脂及成肌腱分化的相關基因mRNA及蛋白表達水平，

5、同時檢測TSCs中MGF mRNA表達水平。
　　第二部分:通過CCK8及實時無標記動態(tài)細胞分析技術檢測TSCs經(jīng)不同濃度MGF處理后，細胞增殖變化情況;通過Transwell、劃痕試驗及激光共聚焦顯微鏡檢測不同濃度MGF處理對TSCs遷移能力及細胞骨架變化的影響;通過Western Blot檢測TSCs經(jīng)不同濃度MGF及MAPK/ERK通路抑制劑PD98059處理后，成腱分化相關基因蛋白表達變化。
　　第三部分:通過Rea

6、l-time PCR和Western Blot分別檢測機械牽伸與MGF共同處理TSCs后，成肌腱、成骨及成脂三系分化相關基因mRNA及蛋白相對表達變化。
　　結果：
　　第一部分:
　　1.4％1Hz組牽伸48h成腱分化指標TNC和成骨分化指標RUNX2相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組均顯著升高(P＜0.05);4％2Hz組各牽伸時間點TNC相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組均明顯升高(P＜0.05)，同時牽拉24h時CEBPα表達受到顯著

7、抑制(P＜0.05)，RUNX2相對表達量較對照組無明顯差異(P＞0.05);8％1Hz組牽拉24h RUNX2表達水平顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)，同時成肌腱分化及成脂肪分化相關基因表達較靜態(tài)培養(yǎng)組無顯著變化(P＞0.05);8％2Hz組牽拉48h時CEBPα表達水平顯著高于靜態(tài)培養(yǎng)組(P＜0.05)，同時RUNX2相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組無顯著差異(P＞0.05)，TNC相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組顯著降低(P＜0.05)。
　

8、　2.不同條件機械牽伸會引起TSCs中MGF mRNA相對表達量出現(xiàn)不同水平的增加。4％2Hz及8％1Hz組牽伸12小時即可見MGF mRNA水平顯著升高(P＜0.05)，牽伸24h時MGF mRNA表達量達到頂峰，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第二部分:
　　1.CCK-8結果顯示:TSCs經(jīng)5ng/ml MGF處理后，24小時開始OD值即出現(xiàn)顯著升高，與其余各組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但其余各組間

9、吸光度無明顯差異(P＞0.05)。RTCA結果顯示:經(jīng)1ng/ml及5ng/ml MGF處理后，TSCs細胞指數(shù)較其余各組均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但兩組間無顯著性差異(P＞0.05);經(jīng)10ng/ml、25ng/ml和50ng/ml MGF及5ng/ml MGF+10μ g/ml PQ401處理后，細胞指數(shù)較對照組顯著降低(P＜0.05);5ng/mlMGF+50μ M PD98059組較其余各組，細胞指數(shù)明顯降低，差

10、異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.劃痕實驗結果顯示:經(jīng)1ng/ml、5ng/ml和10ng/ml MGF處理后，TSCs遷移能力較對照組均明顯加快，其中5ng/ml MGF處理組TSCs的遷移速度最快。Transwell結果顯示:TSCs經(jīng)過不同濃度MGF處理后，TSCs遷移數(shù)量均有顯著增加，OD值顯著升高(P＜0.05)，其中以5ng/ml和7.5ng/ml組最為明顯;另外5ng/ml MGF+50μ M PD98059

11、組與5ng/ml MGF組相比，TSCs遷移數(shù)量明顯減少，OD值顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而5ng/ml MGF+10μg/ml PQ401組細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細胞遷移數(shù)量最少，OD值最低。激光共聚焦顯微鏡觀察可見:經(jīng)0、1.0、2.5、5.0、7.5及10.0ng/mlMGF處理的TSCs，細胞骨架連續(xù)性良好，熒光強，細胞成典型長梭形，肌動蛋白纖維排列規(guī)則;經(jīng)高濃度（25ng/ml及50ng/ml）MGF處理后，

12、TSCs形態(tài)成不規(guī)則形，細胞骨架斷裂，排列紊亂，熒光強度變?nèi)?經(jīng)10μ g/ml PQ401處理后，TSCs細胞形態(tài)出現(xiàn)明顯改變，細胞骨架斷裂，呈顆粒樣，熒光強度極弱。
　　3.Western Blot結果顯示TSCs經(jīng)5ng/ml及10ng/mlMGF處理72h后，TNC、SCX蛋白表達量均較對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而經(jīng)1ng/ml及25ng/ml MGF處理后，蛋白表達較對照組無明顯差異(P＞0.05

13、)。
　　第三部分:
　　1.Real-time PCR結果顯示:TSCs經(jīng)0ng/ml、2.5ng/ml以及5.0ng/ml MGF處理后，在4％2Hz機械牽伸條件下牽伸24h，SCX和TNC mRNA相對表達較靜態(tài)培養(yǎng)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。RUNX2、DLX5以及AP2、PPARγmRNA相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。50μ M PD98059+5ng/mlMG

14、F組TSCs經(jīng)4％2Hz機械牽伸24h后，全部基因的mRNA相對表達量較未添加抑制劑的5ng/ml MGF組變化倍數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.Western blot結果顯示:TSCs經(jīng)0、2、5ng/ml MGF處理后，在4％2Hz機械牽伸下牽拉24h，TNC蛋白相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。RUNX2以及CEBPα蛋白相對表達量較靜態(tài)培養(yǎng)組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(

15、P＜0.05)。50μ M PD98059+5ng/ml MGF組TSCs經(jīng)4％2Hz機械牽伸24h后，全部分化相關基因的蛋白相對表達量較未添加抑制劑的5.0ng/mlMGF組變化倍數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　第一部分:不同條件的機械牽伸會引起TSCs向不同方向分化。4％2Hz24h為誘導成肌腱分化的最佳牽伸條件，8％1Hz24h為誘導成骨分化的最佳牽伸條件，8％2Hz48h為誘導成脂肪分