蓮原花青素的組成和結(jié)構(gòu)及降血糖活性的研究.pdf

1、原花青素是黃烷-3-醇，如(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素由C4-C8鍵或者C4-C6鍵連接的多酚類物質(zhì)。普遍存在于植物界中，特別是在人類的飲食中也廣泛存在。由于原花青素強(qiáng)大的自由基清除能力、重要的生理活性和較好的安全性，最近30多年來，在營養(yǎng)學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域引起了越來越多的關(guān)注。但由于原花青素不穩(wěn)定，且異構(gòu)體繁多，大量制備困難，嚴(yán)重阻礙了其生理活性，構(gòu)效關(guān)系的研究，因此建立原花青素低聚體的快捷、高效的制備方法，有重要的理論和實(shí)際意義。

2、r>　　 在中國南方廣泛分布的水生植物蓮(Nelumbo nucifera Gaertn.)中，含有豐富的低聚體原花青素。本實(shí)驗(yàn)室對其結(jié)構(gòu)和生理活性已有一定研究，但是蓮原花青素(Louts Procyanidins Extract，LPE)更詳細(xì)的組成、結(jié)構(gòu)和更多的生理活性，仍有不少問題需進(jìn)一步的研究。由于原花青素在人類飲食中廣泛存在，研究蓮原花青素對于現(xiàn)代社會中日益增多，且低齡化的糖尿病患者的降血糖作用，有重要意義，同時(shí)也為蓮資源的

3、開發(fā)奠定了基礎(chǔ)，有重要的經(jīng)濟(jì)和社會價(jià)值。
　　 本研究旨在通過簡單，高效和經(jīng)濟(jì)的方法，制備原花青素的低聚體。在此基礎(chǔ)上，研究蓮原花青素的組成和結(jié)構(gòu)。研究蓮原花青素對糖尿病相關(guān)的α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP1B)的抑制作用，并以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的Wistar大鼠糖尿病模型，研究蓮原花青素的降血糖活性。結(jié)果如下：
　　 1．原花青素的制備
　　 采用ADS-17和TSKHW-40s2種材料和低壓

4、柱色譜的方法，從青蛇果提取物中分離得高純度的原花青素B2和C1，并用二級質(zhì)譜，圓二色譜和NMR進(jìn)行了鑒定。同時(shí)，結(jié)合TSKHW-40s柱分級和LC-ESI-MS和MS2，對青蛇果原花青素提取物中的成分進(jìn)行了鑒定，同時(shí)得到了根皮素，槲皮素及其糖苷，（-）-表兒茶素，3種原花青素二聚體，8種原花青素三聚體，9種原花青素四聚體和一種原花青素五聚體。
　　 2．蓮原花青素的提取和穩(wěn)定性
　　 采用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到甲

5、醇提取蓮原花青素的最佳條件為60％甲醇在60℃下提取40min，得率為7.65%（以鮮重計(jì)）。對蓮原花青素水溶液在不同pH和溫度下的穩(wěn)定性研究表明，蓮原花青素的溶液在pH4.8以下，在4℃冰箱和37℃保溫避光保存72h無明顯變化。
　　 3．蓮原花青素的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定
　　 LC-ESI-MS和MS2分析顯示蓮原花青素低聚體主要是兒茶素，表兒茶素，桔兒茶素及其二、三、四聚體。此外，在蓮原花青素30%乙醇級分中，第一次

6、檢測到存在較高含量的槲皮素葡萄糖酸苷。間苯三酚酸降解分析顯示，蓮原花青素乙酸乙酯相平均聚合度為3.21，末端單元有74.2%的兒茶素和25.8%的表兒茶素，延伸單元中，兒茶素、表兒茶素和表桔兒茶素分別占26.0%，43.1%，30.9%。蓮原花青素水相平均聚合度高達(dá)15.39，末端單元有92.8%的兒茶素和7.2%的表兒茶素，延伸單元中，兒茶素、表兒茶素和表桔兒茶素分別占13.4%，32.9%，53.7%。蓮原花青素乙酸乙酯相通過TSK

7、-HW-40s分離得到11個(gè)級分，從中得到了純度較高的(+)-兒茶素，B1，B2，B3二聚體以及少量純度較高的三聚體，取得了比較好的分級效果。蓮原花青素高聚體有待進(jìn)一步的研究。
　　 4．蓮原花青素對3種糖尿病相關(guān)酶類的抑制作用
　　 采用96孔板采用96孔板微量化方法，測定蓮原花青素以及不同聚合度原花青素對α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶，PTP1B活性的抑制，然后以熒光法或者同步熒光法研究蓮原花青素或不同聚合度原花青素對牛

8、血清白蛋白(BSA)，α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅作用。蓮原花青素對α-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶和PTP1B的半數(shù)抑制率(IC50)分別為5.5，1.0和0.33μg/mL。兒茶素，表兒茶素，表?xiàng)攦翰杷亟鬯狨?，B2，C1對這3種酶的抑制顯示聚合度和抑制率呈正相關(guān)。EGCG可以強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶活性，IC50達(dá)到0.93μg/mL，說明原花青素和酶結(jié)合力除了氫鍵相互作用，還有疏水相互作用。熒光和同步熒光分析顯示，B2和BSA，EGCG和α-

9、葡萄糖苷酶通過靜態(tài)結(jié)合從而猝滅熒光，而不是動態(tài)碰撞猝滅，結(jié)合常數(shù)分別為1.5×104和4.75×103。
　　 5．蓮原花青素對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的Wistar大鼠糖尿病的降血糖作用
　　 100、200和300mg/Kg/d的蓮原花青素劑量灌胃鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的Wistar糖尿病大鼠4周，觀察其對大鼠血糖，血清胰島素，C-肽，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)，總膽固醇(TCHO)，總甘油三酸酯(TGA)和其他血清生化指標(biāo)，肝腎病理變化的影響

10、。結(jié)果顯示，蓮原花青素對大鼠體重?zé)o顯著影響，300mg/Kg/d蓮原花青素可以顯著降低wistar大鼠的攝食量和飲水量(p＜0．05)，300mg/Kg/d劑量的蓮原花青素組可以顯著降低Wistar大鼠的血糖值(p＜0．05)，300mg/Kg/d劑量的蓮原花青素組可以顯著降低大鼠血清TCHO，TGA的水平(p＜0．01)。200，300mg/Kg/d劑量的蓮原花青素組極顯著降低血清丙二醛(MDA)含量(p＜0．01)，極顯著增加總超氧