HCV慢性感染患者病毒基因型、NS3區(qū)耐藥相關(guān)變異和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞表位變異的分析.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)具有相當(dāng)高的變異性，HCV感染后多數(shù)可發(fā)展為慢性丙型肝炎，部分患者可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌。HCV基因型可以明顯影響α干擾素抗病毒治療的療效，其中1型與2型HCV感染相比應(yīng)答率較低。NS3蛋白是一種多功能蛋白，在病毒的生命周期中起重要作用，因而成為新型抗HCV藥物的最主要的靶點。NS3蛋白同時也是細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)的識別靶位。目前我國北方地區(qū)缺少近期大樣本HCV基因分型

2、資料，我國患者中HCV NS3區(qū)相關(guān)耐藥變異和CTL表位變異尚未見報道。本文在對767例北方地區(qū)基因型的分析和150例HCV NS3蛋白激酶編碼區(qū)序列分析，以了解我國北方地區(qū)HCV感染患者中近期HCV基因型流行狀況以及蛋白酶抑制劑的天然耐藥相關(guān)變異和CTL表位變異狀況。
　　 目的：(1)對北方地區(qū)慢性HCV感染患者的基因型進(jìn)行分析，以進(jìn)一步了解我國北方地區(qū)近期HCV基因型流行特點。(2)建立擴(kuò)增和檢測我國各種基因型HCV感染患

3、者NS3蛋白激酶編碼區(qū)序列擴(kuò)增分析的方法。(3)對NS3區(qū)進(jìn)行序列分析，揭示我國北方地區(qū)HCV感染患者中與NS3蛋白酶抑制劑相關(guān)耐藥變異和CTL變位變異的特點。
　　 材料與方法：(1)收集767例患者血清樣本，其中慢性丙型肝炎患者518例，慢性丙型肝炎合并肝硬化213例，慢性丙型肝炎合并肝細(xì)胞癌36例。用基因芯片法進(jìn)行HCV基因分型。(2)采用自行設(shè)計的型特異性引物介導(dǎo)巢式反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，對其中150例各種

4、基因型HCV感染患者的NS3區(qū)序列進(jìn)行了PCR產(chǎn)物直接測序分析，部分樣本進(jìn)行了克隆測序分析；通過進(jìn)化樹分析確定HCV基因型，并與基因芯片法測得的基因分型結(jié)果進(jìn)行了比較；分析了NS3區(qū)中與蛋白酶抑制劑teleprovir相關(guān)耐藥位點的變異。(3)采用PCR法對NS3測序患者中的114例進(jìn)行了HLA-A2，A11，A24和A33分型，并對已知A2和A24限制性NS3區(qū)CTL，的表位變異情況進(jìn)行了分析。
　　 結(jié)果：(1)北方地區(qū)76

5、7例慢性HCV感染患者的基因分型結(jié)果為：1b占59.71％，2a占30.90％，1b/2a混合感染占3.26％，6型占2.49％，3a占1.56％，3b占0.91％，1b/3a混合感染占0.52％，2a/3a混合感染占0.26％，1a占0.26％，1a/1b占0.13％。不同診斷的慢性HCV感染者間的基因型分布為顯著差異。(2)建立了NS3基因擴(kuò)增方法可以有效擴(kuò)增各基因型HCV的NS3片段，用NS3測序的150例患者樣本中，1b占66.

6、7％(100/150)，2a占22.7％(34/150)，3a占4％(6/150)，3b占4％(6/150)，6型占2％(3/150)，1a占0.7％(1/150)，與基因芯片法分型結(jié)果有較高的符合率，進(jìn)化樹分析未見NS3序列有地區(qū)性聚集傾向。未檢出與新型HCV蛋白酶抑制劑telaprevir耐藥相關(guān)的V36M/A，T54A，R155K/T和A/156V/T變異。(3)HLA分型顯示，114例患者樣本中檢出A2陽性43例，占37.7％，

7、A11陽性44例，占38.6％，A24陽性27例，占23.7％，A33陽性16例，占14.3％。未檢出上述4種型別的有13例，占11.4％。通過對表位A2和A24的變異分析表明，在HCVNS3區(qū)A2(CINGVCWTV)/(LLCPSGHAN)和A24(AYSQQTRGL)表位均存在明顯的變異情況，并且多數(shù)變異表位中有多個氨基酸發(fā)生了替換。
　　 結(jié)論：(1)在我國北方地區(qū)以1b型HCV感染最為常見，2a型HCV感染次之。(2)