鼠疫耶爾森氏菌PhoP-RovA psa轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路研究;正確作者-張義全;正確導師-宋亞軍.pdf

1、鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)引起的一種自然疫源性疾病。鼠疫菌在傳播環(huán)節(jié)中宿主動物的改變以及致宿主病變的過程中，受到諸多環(huán)境信號，比如抗菌肽、溫度、pH、滲透壓等的刺激，鼠疫菌能感應這種復雜的信號刺激并自我調(diào)節(jié)，產(chǎn)生毒力因子，最終使鼠疫菌得以存活。鼠疫菌自我調(diào)節(jié)機制中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控子對靶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)節(jié)至關(guān)重要。PhoP和RovA是鼠疫菌重要的毒力調(diào)控因子，pH6抗原是鼠疫菌重要的毒力相關(guān)因子，它們之間聯(lián)系至今并未被闡明。<

2、br>　　 PhoP是二元調(diào)節(jié)系統(tǒng)PhoP-PhoQ的調(diào)節(jié)蛋白，PhoP-PhoQ系統(tǒng)能夠感應低Mg2+、微酸性環(huán)境以及抗菌肽的刺激信號，從而激活PhoP蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性，上調(diào)或下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，鼠疫菌PhoP蛋白是整體調(diào)控子，表達譜結(jié)果表明，在低Mg2+條件下，有706個基因的轉(zhuǎn)錄受PhoP的影響，包括pH6抗原基因、PhoP-PhoQ系統(tǒng)及rovA基因。
　　 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌rovA缺失株對小

3、鼠毒力下降，表明RovA是其重要的毒力調(diào)控因子。RovA能以二聚化的形式結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，在小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核耶爾森氏菌中，它不僅能激活侵襲因子基因inv的表達，還能激活自身的表達以及其他毒力相關(guān)基因的表達。在鼠疫菌中，也有學者進行了RovA的芯片表達譜分析，發(fā)現(xiàn)RovA是一個全局性毒力調(diào)控因子，能調(diào)控數(shù)十個基因的表達，包括pH6抗原基因，但是詳細調(diào)控機制還沒見報道。
　　 鼠疫菌pH6抗原由基因簇ps

4、aEFABC編碼，其中psaABC編碼結(jié)構(gòu)亞單位(A)及其伴侶蛋白(B)和膜引領(lǐng)蛋白(C)；而psaEF表達產(chǎn)物可能對psaA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。pH6抗原最高表達是在環(huán)境pH=6、溫度在34℃或更高條件下實現(xiàn)，且只有在34℃以上才能發(fā)揮毒力效應。pH6抗原是鼠疫菌的毒力相關(guān)因子，與腺鼠疫的發(fā)生密切相關(guān)。
　　 根據(jù)表達譜和生物信息學預測，在轉(zhuǎn)錄水平上，PhoP對psaA、psaE、自身操縱子基因以及rovA可能具有調(diào)控作用，同時R

5、ovA對自身基因及psaA、psaE的轉(zhuǎn)錄也可能具有調(diào)節(jié)作用。本研究的目的在于闡明上述調(diào)控子對可能的靶基因的調(diào)控機制。
　　 我們基于Red系統(tǒng)分別構(gòu)建了鼠疫菌phoP和rovA基因的突變株，利用大腸桿菌BL21λDE3的蛋白表達系統(tǒng)分別獲得His-PhoP和His-RovA重組蛋白，再利用凝膠阻滯實驗(EMSA)、DNase I足跡實驗、β-半乳糖苷酶報告基因融合實驗(LacZ實驗)以及引物延伸實驗等來詳細研究PhoP和Rov

6、A對各自靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　 實驗結(jié)果表明：在低Mg2+、對數(shù)生長中期條件下，在轉(zhuǎn)錄水平上PhoP抑制psaA、psaE、rovA的表達，而激活自身操縱子基因YPO1635、phoP的轉(zhuǎn)錄；pH5.8、對數(shù)生長中期條件下，在轉(zhuǎn)錄水平上PhoP抑制psaA的表達，而對其它所研究基因無影響；在對數(shù)生長中期，RovA能激活psaA、psaE以及rovA的轉(zhuǎn)錄；在對數(shù)生長中期，psaA的轉(zhuǎn)錄受酸的調(diào)節(jié)，pH5.8較pH7.2條件

7、下高表達，但是溫度對其無影響。
　　 在rovA基因啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了兩個轉(zhuǎn)錄起始位點，分別命名為P1和P2，其中P1靠近翻譯起始位點，它的轉(zhuǎn)錄啟動受PhoP的抑制而受RovA的激活，P2只受RovA的激活而不受PhoP的影響；DNase I足跡實驗表明RovA對自身啟動子區(qū)有兩個親和力不等的結(jié)合位點site1和site2，前者親和力高于后者，site1位于P2之前，因此我們認為site1控制著P2的轉(zhuǎn)錄，site2位于P1之后，推

8、測RovA與site2的結(jié)合對rovA的轉(zhuǎn)錄具有負反饋調(diào)節(jié)作用，即RovA的自調(diào)控是雙重性質(zhì)的。
　　 在psaE啟動子區(qū)分別得到了PhoP和RovA的結(jié)合位點，并發(fā)現(xiàn)了三個距離很近的轉(zhuǎn)錄起始位點，PhoP的結(jié)合位點幾乎覆蓋了這三個位點，RovA的結(jié)合位點緊挨著PhoP結(jié)合位點位于其上游而遠離轉(zhuǎn)錄起始位點，體內(nèi)實驗也證明，在特定條件下PhoP對psaE轉(zhuǎn)錄具有抑制作用，而對rovA具有激活作用。
　　 PhoP和RovA

9、對psaA啟動子的結(jié)合位點互相重疊，都位于轉(zhuǎn)錄起始位點之后，體內(nèi)實驗表明，無論是高Mg2+還是低Mg2+以及酸性環(huán)境下，RovA對psaA的轉(zhuǎn)錄都具有促進作用，但足在低Mg2+和酸性條件下，PhoP對psaA的調(diào)控具有抑制作用，由此可見，PhoP和RovA通過競爭psaA啟動子區(qū)相同的結(jié)合位點，共同調(diào)節(jié)psaA的轉(zhuǎn)錄。
　　 低Mg2+條件下，YPO1635受PhoP的正調(diào)控在其它文獻資料中已經(jīng)得到驗證，本文也證明了這種調(diào)控關(guān)系

10、，同時也證明了PhoP確實正調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄，但足所發(fā)現(xiàn)的兩個轉(zhuǎn)錄起始位點P1和P2，在細菌生長對數(shù)中期時只有P2是PhoP依賴性的。
　　 綜上，本研究利用分子生化試驗手段，首次揭示了鼠疫菌中的PhoP-RovA-psa轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)路：RovA正調(diào)控psa位點和自身的轉(zhuǎn)錄；低Mg2+環(huán)境下，PhoP抑制psa位點和rovA的轉(zhuǎn)錄，而激活自身操縱子的轉(zhuǎn)錄，PhoP也能感應酸性信號，抑制psaA的轉(zhuǎn)錄；psaA的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)還受酸的調(diào)節(jié)，