多克隆抗體介導(dǎo)的獲得性ADAMTS13缺陷小鼠模型的建立.pdf

1、目的:
　　血栓性血小板減少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura，TTP)是一種臨床上少見但嚴(yán)重危及患者生命的血栓性微血管病。其主要臨床特征為血小板計(jì)數(shù)減低、微血管病性溶血性貧血、神經(jīng)精神癥狀、腎臟損害和發(fā)熱。如前三者同時存在稱之為TTP“三聯(lián)癥”，若三聯(lián)癥基礎(chǔ)上合并腎臟損害和發(fā)熱則稱之為TTP“五聯(lián)征”。TTP的基本發(fā)病機(jī)制是血漿中裂解血管性血友病因子(von Willebrand fa

2、ctor，VWF)的金屬蛋白酶ADAMTS13活性的嚴(yán)重減低。根據(jù)病因和發(fā)病機(jī)制的不同，TTP可以分為遺傳性TTP（Upshaw-Schulman綜合征）和獲得性TTP。其中，遺傳性TTP的ADAMTS13活性降低是由于ADAMTS13的基因突變所致，而獲得性TTP則是由于患者血漿中存在的針對ADAMTS13的自身抗體或抑制物導(dǎo)致的ADAMTS13活性降低。在美國，每年新發(fā)獲得性TTP比例為3-10例/百萬人群。據(jù)此推算，我國每年新增的

3、獲得性TTP患者人數(shù)應(yīng)在5000人以上。在發(fā)現(xiàn)ADAMTS13的最初一段時間很多學(xué)者認(rèn)為單獨(dú)的ADAMTS13活性缺乏可以引發(fā)TTP。但隨著研究的深入，人們逐漸對上述觀點(diǎn)產(chǎn)生了質(zhì)疑。本實(shí)驗(yàn)通過應(yīng)用抗ADAMTS13的多克隆抗體ab71550來建立獲得性ADAMTS13缺陷的129×1/SvJ系小鼠模型，以進(jìn)一步探究單獨(dú)的獲得性ADAMTS13活性缺陷是否能夠?qū)е滦∈蟀l(fā)生TTP，抑或是ADAMTS13基因敲除小鼠一樣僅僅表現(xiàn)為體內(nèi)的高凝狀

4、態(tài)。
　　方法:
　　1、研究對象的選取和分組:選取7只129×1/SvJ系小鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。實(shí)驗(yàn)組3只，對照組4只。另取1只小鼠，增加實(shí)驗(yàn)組用藥劑量重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
　　2、觀察和檢測項(xiàng)目:小鼠神經(jīng)精神改變、小鼠外周血涂片破碎紅細(xì)胞鏡檢、微量血血小板計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度測量、ADAMTS13活性測定（FRETS-VWF86熒光底物法）、UL-VWF多聚體分析（VWF垂直電泳法）和組織病理學(xué)分析。
　　3、標(biāo)

5、本的采集與處理:采用小鼠內(nèi)眥靜脈取血方法，以檸檬酸鈉抗凝，離心后留取血漿，-70℃凍存?zhèn)溆?。另取微量血進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)和血紅蛋白濃度測定，同時留取外周血涂片，顯微鏡觀察有無破碎紅細(xì)胞。共計(jì)采血5次，分別留取用藥前、用藥24小時、48小時、72小時、96小時的血液標(biāo)本備用。最后一次采血結(jié)束后，將小鼠麻醉并脫頸椎處死，解剖留取肝臟、腎臟、脾臟、心臟和腦組織，并將上述組織用福爾馬林固定，備用組織病理分析。
　　4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:用SPSS1

6、6.0對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（包括血小板計(jì)數(shù)、ADAMTS13活性及血紅蛋白濃度）進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)性分布后以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。兩組間采用student t-test檢驗(yàn)方法，以P值＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)組和對照組(抗體用藥劑量均為600ug/kg)
　?、偕窠?jīng)精神癥狀:整個實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠均未出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀改變。
　　②外周血涂片:實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)組和對照

7、組動物外周血涂片鏡檢均未發(fā)現(xiàn)破碎紅細(xì)胞。
　?、垩“逵?jì)數(shù)相關(guān)分析:實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠在用藥前、用藥24小時、48小時、72小時和96小時的血小板計(jì)數(shù)無差別（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，方差齊，P＞0.05）。
　?、苎t蛋白濃度分析:實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠在用藥前、用藥24小時、48小時、72小時和96小時的血紅蛋白濃度無差別（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，方差齊，P＞0.05）。線形圖顯示實(shí)驗(yàn)觀察時間范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)組血紅蛋白濃度變化趨勢穩(wěn)于對

8、照組。
　　⑤血漿ADAMTS13活性測定:實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠在用藥前ADAMTS13活性測定無差別(P＞0.05);應(yīng)用藥物24小時、48小時、72小時和96小時后實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠ADAMTS13活性出現(xiàn)差別。線形圖顯示對照組ADAMTS13活性在實(shí)驗(yàn)觀察時間內(nèi)無明顯波動，實(shí)驗(yàn)組ADAMTS13活性在應(yīng)用抗體48h時降至最低，低至10％以下，此后逐漸恢復(fù)。（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布，方差齊，P＞0.05）
　?、轛WF多聚體

9、分析:對照組動物體內(nèi)不存在超大分子量VWF(UL-VWF)多聚體，而實(shí)驗(yàn)組小鼠在應(yīng)用抗體48h時出現(xiàn)UL-VWF多聚體。
　?、卟±斫M織血檢測:實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠的肝臟、腎臟、心臟、脾臟和腦組織的病理組織分析中均未見微血栓形成。
　　2、增加實(shí)驗(yàn)組用藥劑量(1000ug/kg)
　　小鼠于用藥48h采血過程中出現(xiàn)死亡。實(shí)驗(yàn)過程中小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)精神癥狀;外周血無破碎紅細(xì)胞;血紅蛋白和血小板測定未見明顯波動;ADAMTS1

10、3活性較前進(jìn)一步降低;VWF電泳顯示存在UL-VWF;病理分析亦未發(fā)現(xiàn)微血栓形成。
　　結(jié)論:
　　抗ADAMTS13抗體ab71550能夠抑制129×1/SvJ小鼠血漿ADAMTS13的活性，并出現(xiàn)UL-VWF多聚體，但并未誘發(fā)血小板計(jì)數(shù)減低、微血管性溶血性貧血、神經(jīng)精神癥狀以及微血栓形成等TTP的相關(guān)改變。由此推斷:單獨(dú)抗體介導(dǎo)的獲得性ADAMTS13活性缺陷小鼠并不能發(fā)生TTP，TTP的發(fā)生的可能還需要其它遺傳和（或）