骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠腦出血后血腦屏障的保護作用及機制研究.pdf

1、腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是常見的腦血管病之一，也是一種對人類健康有著嚴重危害的疾病，它的發(fā)病率、致殘率以及死亡率都比較高。
　　骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)，是擁有多向分化潛能并且能進行自我復(fù)制的成體干細胞。它主要來源于骨髓組織，能夠進行自我更新，具有分化為骨細胞、心肌細胞、肝細胞和膠質(zhì)細胞等的潛能。MSCs具有相對其它細胞來說更容

2、易獲取的渠道，也具有分離后容易傳代培養(yǎng)的特點。而正是基于BMSCs擁有的這些優(yōu)點使得它們成為研究許多疾病治療的理想種子細胞，其中就包括應(yīng)用在腦出血疾病中的治療研究。以往的研究表明MSCs能夠通過遷移到損傷部位增加內(nèi)源性細胞增殖和促進血管生成等作用，達到對腦出血的治療效果。但是近年來的一些研究表明，通過分泌多種細胞營養(yǎng)因子、生長因子及多種黏附分子等旁分泌作用，可能是MSCs發(fā)揮治療效果的主要機制。
　　隨著研究的增多和深入，MSCs

3、旁分泌作用越來越引起人們的關(guān)注。在一些組織創(chuàng)傷模型試驗中，通過研究已經(jīng)明確了MSCs的旁分泌作用對于促進組織創(chuàng)傷的愈合和功能的恢復(fù)具有治療效果，其中包括心肌梗死、急性腎小管損傷、角膜損傷、肝功能損傷和顱腦外傷等實驗?zāi)Ｐ?。通過MSCs的旁分泌作用，可以抑制細胞的凋亡、促進創(chuàng)傷組織細胞的分化、誘導(dǎo)血管新生和減輕炎癥反應(yīng)等達到治療效果。有研究發(fā)現(xiàn)MSCs能通過旁分泌作用促進心梗邊緣區(qū)新生微血管的形成;也有研究發(fā)現(xiàn)通過MSCs的旁分泌作用促進腦

4、梗塞疾病中梗死半暗區(qū)得到營養(yǎng)支持、抑制細胞凋亡和促進新生血管的形成;另外在MSCs的旁分泌作用下通過抗炎和免疫調(diào)節(jié)機制達到對腦損傷的相關(guān)研究也獲得了證實?？偠灾?，目前已經(jīng)有不少研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)MSCs通過旁分泌機制在許多疾病中都能達到治療效果。
　　大量研究發(fā)現(xiàn)，MSCs移植能夠通過促進神經(jīng)細胞增殖分化、減少細胞凋亡和一定程度上減輕炎癥反應(yīng)達到對腦出血的治療效果。盡管有一些實驗已經(jīng)通過研究發(fā)現(xiàn)MSCs能夠通過旁分泌機制分泌一些可溶性

5、因子，例如白細胞介素10(IL-10)、吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine2，3-dioxygenase)和前列腺素E2(prostaglandin E2)發(fā)揮生物學(xué)特性，而且近年來一種叫腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6(TNF-stimulated gene6 protein，TSG-6)的抗炎因子在MSCs發(fā)揮作用的過程中引起越來越多的重視，但是MSCs移植能否通過旁分泌機制，減輕腦出血后BBB的破壞進而減輕腦水腫的程度，最終達到

6、對腦出血治療的研究卻尚未見到報道。所以，本實驗使用SD大鼠的腦出血模型，通過靜脈移植MSCs來研究它對大鼠腦出血后血腦屏障和腦水腫的影響，探究其中可能涉及的機制，為更加全面地理解MSCs移植治療腦出血提供更加深刻的研究基礎(chǔ)。
　　第一章:大鼠骨髓MSCs收集、培養(yǎng)及細胞鑒定
　　目的:
　　從SD大鼠股骨和脛骨分離細胞后利用全骨髓貼壁法對骨髓MSCs進行培養(yǎng)最終獲取作為干細胞移植的理想種子。
　　方法:
　

7、　取5周大小的SD大鼠，取其股骨和脛骨，以1×106cells/25cm2密度接種骨髓細胞，當(dāng)細胞生長至大約90％融合時消化貼壁細胞進行傳代，取第3代MSCs用于本實驗的研究，通過流式細胞儀對獲取的MSCs進行細胞表型鑒定，相關(guān)的表型包括CD29、CD34、CD44、CD45和CD90。
　　結(jié)果:
　　通過流式細胞儀檢測第3代MSCs結(jié)果為，CD29:99.52％，CD44:94.63％, CD90:99.65％; CD3

8、4:1.61％, CD45:0.95％。CD29、CD44和CD90為高表達，CD34和CD45為低表達。
　　結(jié)論:
　　本實驗通過全骨髓貼壁分離培養(yǎng)法，獲得了純度較高和生物學(xué)特性較穩(wěn)定的MSCs。相關(guān)的細胞表型也符合國際上對MSCs的標準。所以我們獲取的MSCs可以作為合適的種子用于本實驗的干細胞移植治療的研究。
　　第二章:BMSCs對大鼠腦出血后BBB破壞的保護作用
　　目的:
　　建立大鼠的腦出血

9、模型，在不同的時間點檢測與BBB破壞密切相關(guān)的物質(zhì)，包括iNOS、ONOO-、MMP-9、緊密連接蛋白claudin-5和ZO-1等的表達，以及給予MSCs治療后這些物質(zhì)與神經(jīng)功能的變化情況，從而為MSCs應(yīng)用于臨床腦出血的治療提供新的參考依據(jù)。
　　方法:
　　本研究中，我們通過使用注射Ⅳ型膠原酶來建立大鼠腦出血的模型。SD大鼠被隨機分為假手術(shù)組、PBS模型組（腦出血+PBS組）、MSCs移植治療組（腦出血+MSCs組）。

10、模型組與假手術(shù)組造模過程基本一樣，唯一不同的是模型組是用10-uL的微量注射器在右側(cè)紋狀體注射含有0.5IU的Ⅳ型膠原酶2uL，而假手術(shù)組是將微量注射器刺入右側(cè)紋狀體而不注射Ⅳ型膠原酶。在大鼠腦出血造模后2h，MSCs移植治療組通過靜脈系統(tǒng)將經(jīng)鑒定合格的濃度為5×106個/ul的200ul細胞緩慢注入，而腦出血模型組則是注射等量的200ul磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)。我們通過免疫組織化學(xué)技

11、術(shù)來確定Iba-1+小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞和MPO+嗜中性粒細胞的密度;通過TUNEL法檢測細胞凋亡;通過ELISA法檢測與炎癥相關(guān)的細胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-10、tumor necrosisfactor(TNF)-α、interferon(IFN)-γ和transforming growth factor(TGF)-β1;通過免疫熒光技術(shù)檢測與BBB破壞程度密切相關(guān)的ZO-1、iNOS和3-NT;通過WesternBl

12、ot方法檢測相應(yīng)蛋白表達變化，其中包括ZO-1、Claudin-5、iNOS、3-NT和MMP-9，而這些蛋白與BBB的通透性有著緊密的聯(lián)系。
　　結(jié)果:
　　通過免疫組織化學(xué)技術(shù)法發(fā)現(xiàn)，在術(shù)后第3天PBS模型組較假手術(shù)組的Iba-1+小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞和MPO+嗜中性粒細胞在密度上明顯增加，而MSCs移植治療組有效地減少它們在模型組中的增加。在ELISA法檢測中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第1、3和7天，與炎癥相關(guān)的細胞因子也是在MSCs

13、治療后明顯降低。免疫熒光檢測結(jié)果提示在術(shù)后第3天，MSCs移植治療組能有效增加在PBS模型組中降低的ZO-1表達量，同時降低在模型組中升高的iNOS和3-NT表達量。經(jīng)過Western Blot檢測同樣可見，與PBS模型組中升高的iNOS、3-NT和MMP-9相比，MSCs移植治療組在有效地降低了這幾種與BBB破壞性密切相關(guān)的蛋白表達量的同時卻增加了ZO-1和Claudin-5這些緊密連接蛋白的表達。
　　結(jié)論:
　　腦出血

14、后相關(guān)產(chǎn)物的形成，對BBB的正常結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞從而增加其通透性并加重腦水腫的程度，如iNOS、3-NT和MMP-9等產(chǎn)物對腦血管內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白claudin-5/ZO-1產(chǎn)生的破壞作用。通過靜脈移植MSCs能夠有效地減少上述產(chǎn)物的表達量從而減輕BBB的破壞程度。
　　第三章:BMSCs對大鼠腦出血后BBB保護作用的機制研究
　　目的:
　　目前一些研究發(fā)現(xiàn)MSCs移植能夠?qū)δX出血有一定的治療效果，但是主要的機制主要

15、是與促進神經(jīng)細胞分化和誘導(dǎo)血管新生等相關(guān)，很少有關(guān)于MSCs作用于腦出血后BBB通透性方面的研究，而BBB通透性恰恰與腦出血后腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)。所以我們通過建立腦出血模型，使用靜脈系統(tǒng)移植MSCs來研究它對腦出血后BBB通透性影響的機制。
　　方法:
　　造模和分組與第二章“BMSCs對大鼠腦出血后BBB破壞的保護作用”采用的方法一樣，通過Ⅳ型膠原酶建立大鼠腦出血的模型，并將SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、PBS腦出血模型組、

16、MSCs移植治療組。通過mNSS評分系統(tǒng)，評估腦出血后1和3天大鼠的神經(jīng)運動功能情況。用腦水含量和伊文斯蘭(Evan，sblue，EB)檢測的方法，評估腦出血后1和3天大鼠的腦水腫和BBB破壞程度。通過RT-PCR技術(shù)檢測免疫抑制相關(guān)抗炎因子TSG-6的表達情況，而WesternBlot技術(shù)除TSG-6之外，也對NF-κB信號通路進行檢測。
　　結(jié)果:
　　通過mNSS評分系統(tǒng)和對大鼠腦水含量以及EB檢測的方法，我們發(fā)現(xiàn):與

17、假手術(shù)組相比，在腦出血后的1和3天，PBS模型組的大鼠mNSS評分升高，BBB通透性以及腦水腫的程度明顯增加。而在MSCs治療組，mNSS評分得到下降，BBB通透性和腦水腫的程度也有不同程度的改善。不管是RT-PCR還是WesternBlot技術(shù)都發(fā)現(xiàn)，相對假手術(shù)組和PBS模型組，TSG-6的表達量在MSCs治療組顯著增加，而通過Western Blot對NF-κB信號通路的檢測發(fā)現(xiàn)，MSCs能夠抑制IκBs在模型組降低的趨勢，相反卻能