枸杞ACE抑制肽的提取、分離純化、活性測定及其結(jié)構(gòu)鑒定.pdf

1、目的：血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制肽在腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中對血壓的調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵的作用，對食物蛋白源性的ACE抑制肽的研究已經(jīng)成為防治高血壓的熱點(diǎn)。本研究通過探討天然食物枸杞ACE抑制肽的提取工藝、體外的活性測定、分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定等研究，為制備天然枸杞ACE抑制肽提供理論依據(jù)。
　　方法：稱取50g的枸杞粉，運(yùn)用堿提酸沉法提取枸杞粗蛋白，采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定了堿提過程的pH值和酸沉過程的pH值；采用L9(

2、33)正交實(shí)驗(yàn)的方法，確定最佳的加酶量、底物濃度和提取時(shí)間；制備枸杞粗蛋白的酶解液，并測定其多肽的含量及其活性；運(yùn)用RP-HPLC分離枸杞ACE抑制肽；以呋喃丙烯酰三肽（FAPGG）為模擬底物，通過檢測血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）酶解FAPGG生成的N-(3[2-呋喃]丙烯酰)-苯基丙氨酸（FAP）和雙甘氨肽（GG），測定ACE抑制肽的抑制率；通過反向高效液相色譜（RP-HPLC）法，對分離純化的枸杞蛋白酶解物進(jìn)行純化分析檢測，確定枸杞蛋

3、白酶解物中的組分；利用液質(zhì)連用（LC MALDI TOF/TOF/MS）以及二級質(zhì)譜進(jìn)行分析，最終確定分離純化出的枸杞蛋白酶解物組分中所含的肽鏈結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：①堿提酸沉法提取枸杞粗蛋白時(shí)堿提過程中的pH值為8.5；酸沉過程pH值為4.0；經(jīng)過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，提取最高抑制率的枸杞ACE抑制肽的條件：提取時(shí)間3小時(shí)，底物濃度20％，加酶量1%。枸杞粗蛋白經(jīng)酶解后，其多肽的含量為8.5mg/ml；ACE的抑制率平均值穩(wěn)定在90.01%

4、，最高值可達(dá)99.03%。②將所提取的枸杞蛋白酶解液經(jīng)過Sephadex G-25凝膠柱和SP Sephadex C-25陽離子交換柱分離并純化后，在波長200nm條件下，洗脫組分分管收集到6個峰，分別測定6個組分的ACE抑制率88.62%、87.71%、91.24%、89.56%、89.87%和88.02%，隨后選取ACE抑制率最高的組分，進(jìn)入高效液相色譜進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，得到所提取的枸杞蛋白酶解液中活性最高的13個組分，將所得13

5、個組分分別測定其活性，分別為61.99%、81.77%、78.73%、85.23%、76.24%、67.28%、63.66%、94.34%、82.28%、73.85%、82.35%、67.06%和74.92%；并再次進(jìn)入反向高效液相色譜進(jìn)行分離純化得到最終的3個組分，并對其中活性最高的組分進(jìn)行ACE抑制率的測定，分別為95.33%、88.26%和84.62%。③通過LC MALDI TOF/TOF/MS和二級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析可以得出其中活性

6、較高的組分中的主要氨基酸肽鏈有兩條，主要是由FNPR（phe-asn-pro-arg）和WRAYGSG（trp-arg-gla-tyr-gly-ger-gly）組成。
　　結(jié)論：①經(jīng)過優(yōu)化條件的堿提酸沉法提取枸杞中的ACE抑制肽的抑制率平均可達(dá)90.01%。②采用離子交換色譜、凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜等分離手段，從酶解物中分離出一種新的強(qiáng)活性ACE抑制肽，其抑制率可達(dá)到95.33%。③通過LC MALDI TOF/TOF/M