核桃蛋白源ACE抑制肽的純化、結(jié)構(gòu)鑒定及性質(zhì)研究.pdf

1、心血管疾病是引起人類死亡的頭號殺手，而高血壓是引起腦卒中、腎臟衰竭、心肌梗死等心血管疾病的主要誘因，控制好高血壓，有利于降低心血管疾病的發(fā)病率。目前，化學(xué)合成的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（ACE）抑制劑是治療高血壓疾病重要的一類臨床藥物。食物蛋白源ACE抑制肽具有來源廣泛、無毒副作用、降壓效果好、安全系數(shù)高等特點，具有廣闊的應(yīng)用價值。本課題以核桃蛋白 Alcalase酶解液為研究對象，采用多種分離純化技術(shù)，鑒定出兩種ACE抑制率較高的多肽，并對其

2、性質(zhì)進(jìn)行研究，為核桃蛋白源ACE抑制肽的開發(fā)應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　本課題的主要研究結(jié)論：
　?。?）分子排阻色譜純化核桃蛋白源ACE抑制肽條件優(yōu)化。結(jié)果表明，以Sephadex G-15為分離介質(zhì)的色譜優(yōu)化條件為：超純水為洗脫劑，洗脫流速0.4 mL/min，上樣體積1.5 mL，樣品濃度150 mg/mL。在此條件下，經(jīng)分子排阻色譜純化后，得到4個主要組分，其中組分G4的ACE抑制率最高，達(dá)到90.35％，其I

3、C50值為0.158 mg/mL。經(jīng)過RP-HPLC進(jìn)一步分離，高活性組分保留時間主要集中于10 min、13 min、16-18 min和21 min，經(jīng)氨基酸分析儀測定發(fā)現(xiàn)疏水性氨基酸的含量得到顯著富集，其中芳香族氨基酸Tyr、Phe的含量分別達(dá)10.46%和20.15%。
　?。?）半制備型和分析型兩次液相色譜法純化核桃蛋白源ACE抑制肽。利用半制備液相分離純化后得到六個組分，其中組分C的ACE抑制率最高。分析型液相色譜對組

4、分 C進(jìn)一步分離純化，得到五個組分，其中組分 C3的ACE抑制率最高。
　?。?）核桃蛋白源 ACE抑制肽結(jié)構(gòu)鑒定及化學(xué)合成。通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MALDI-TOF/MS）鑒定C3組分的結(jié)構(gòu)，鑒定出兩種ACE抑制肽，氨基酸序列分別為Leu-Tyr（LY）和Tyr-Leu-Ala（YLA），其相對分子質(zhì)量分別為295.19 Da和366.24 Da。采用固相合成的方法合成肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala，測定其IC5

5、0值，分別為42μmol/L和396μmol/L，均具有較強(qiáng)的ACE抑制效果。
　　（4）核桃蛋白源ACE抑制肽性質(zhì)研究。肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，在80℃條件下加熱3 h，保存率均在80%以上。同時多肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有較強(qiáng)的抗消化性：在人工胃液條件下，多肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有良好的抗胃蛋白酶消化性，反應(yīng)5 h后，多肽的保存率為85%；在人工腸液條件

6、下，肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有良好的抗胰蛋白酶消化性，反應(yīng)5 h后，肽的保存率為80%。實驗對肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala的抗氧化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肽Tyr-Leu-Ala的抗氧化能力較弱，但是肽Leu-Tyr在濃度為1.00 mg/mL條件下，對ABTS自由基的清除能力高達(dá)76.4%，是相同條件下還原性谷胱甘肽（GSH）清除能力的75.2%，說明ACE抑制肽Leu-Tyr同時具有較強(qiáng)的ABTS自由基