血管緊張素Ⅱ與ACS斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本文從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面，觀察AngⅡ?qū)ν脛?dòng)脈斑塊形成的影響，離體VSMC的形態(tài)與功能的作用，以及與膠原蛋白、PAPPA、MMP-9等相關(guān)蛋白的關(guān)系，來探討AngⅡ在粥樣硬化斑塊形成和破裂中的作用機(jī)制。 第一部分: AngⅡ?qū)ν肁S斑塊的影響及纈沙坦的干預(yù)作用 目的: 通過高脂飼料喂養(yǎng)兔，并給予AngⅡ及纈沙坦干預(yù).觀察兔血脂的變化及AS斑塊形成情況，以探討AngⅡ?qū)ν醚癆S斑塊形成的影響及其作用機(jī)制，

2、同時(shí)探討纈沙坦降低血脂，減輕AS斑塊形成的作用。 方法: 1、實(shí)驗(yàn)采用雄性新西蘭純種大白兔24只，隨機(jī)分為四個(gè)組：1）對(duì)照組：普通飼料飼養(yǎng)；2）高脂組：?jiǎn)渭兏咧暳衔桂B(yǎng)；3）AngⅡ組：高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)注射AngⅡ，每次劑量為500ng/kg，每周注射3次；4）纈沙坦組：高脂飼料喂養(yǎng)，同時(shí)以3 mg/Kg/d纈沙坦灌胃，每日給藥1次。 2、試驗(yàn)開始前、試驗(yàn)后4周、8周和12周4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)體重1次；試驗(yàn)前及1

3、2周時(shí)分別取外周血測(cè)血脂。 3、HE染色觀察主動(dòng)脈病理學(xué)改變，斑塊形成情況，以及內(nèi)膜與中層厚度。 4、免疫組織化學(xué)檢測(cè)MMP-9蛋白的表達(dá)水平。 5、RT-PCR法檢測(cè)MMP-9 mRNA的表達(dá)。 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間均數(shù)比較以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行，多組間均數(shù)比較以O(shè)

4、NE-WayANOVA進(jìn)行，4組MMP-9的免疫組化比較采用Kruskall-Willis方法。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1、兔總體生長(zhǎng)良好。實(shí)驗(yàn)過程中共有3只兔死亡，實(shí)際用于結(jié)果分析的共21只。4周及8周，兔體重，高脂組>AngⅡ組>纈沙坦>對(duì)照組（P<0.01）；12周時(shí)，纈沙坦>對(duì)照組>高脂組>AngⅡ組（P<0.01）。0周時(shí)總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白3項(xiàng)指標(biāo)各實(shí)驗(yàn)組之間比較均無明顯差異（P>

5、0.05）；12周時(shí)，AngⅡ組>高脂組>纈沙坦>對(duì)照組（P<0.01）。 2、血管的形態(tài)：對(duì)照組主動(dòng)脈色澤紅潤(rùn)，管腔光滑，內(nèi)膜、中膜完整，無脂質(zhì)沉積。高脂組內(nèi)膜增厚新月形隆起，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，內(nèi)膜下泡沫細(xì)胞，與中膜的分界模糊，中膜萎縮變薄，VSMC減少。AngⅡ組內(nèi)膜斷裂，內(nèi)皮細(xì)胞脫落，新生內(nèi)膜形成，內(nèi)膜明顯增厚形成粥樣斑塊，內(nèi)含有大量的泡沫細(xì)胞及脂質(zhì)核心，嚴(yán)重者斑塊融合成片，部分出現(xiàn)潰瘍糜爛，中膜明顯萎縮，膠原纖維呈玻璃樣變性

6、；纈沙坦組血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞仍存在，內(nèi)膜和中膜的分層較清晰。 5、斑塊發(fā)生率：AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組（P<0.01）；對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)斑塊形成。 6、血管內(nèi)膜厚度：AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對(duì)照組（P<0.05）。中層厚度：AngⅡ組<高脂組/纈沙坦組<對(duì)照組（P<0.05），高脂組與纈沙坦組無明顯差異（P>0.05）。內(nèi)膜厚度/中層厚度：AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對(duì)照組（P<0.05）。 7、

7、免疫組化MMP-9陽性統(tǒng)計(jì)：將MMP-9的表達(dá)量化后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，AngⅡ組>高脂組>纈沙坦組>對(duì)照組（P<0.05）。 8、MMP-9 mRNA表達(dá)量：AngⅡ組>高脂組>對(duì)照組>纈沙坦組（P<0.01）。 結(jié)論: 1、兔可以作為研究AS斑塊的良好動(dòng)物模型，高脂飼料喂養(yǎng)可以模擬出AS斑塊，AngⅡ可以促進(jìn)和加劇AS斑塊的形成。 2、AngⅡ可以促使主動(dòng)脈中層VSMC向內(nèi)膜遷移，導(dǎo)致血管內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)血管狹窄

8、。 3、AngⅡ可以誘導(dǎo)兔MMP-9 mRNA的高表達(dá)，并能增加MMP-9蛋白的分泌。 4、AngⅡ?qū)MP-9的影響與其對(duì)斑塊的形成、血管內(nèi)膜增厚血管狹窄的作用一致。 5、AngⅡ受體拮抗劑纈沙坦可以拮抗AngⅡ的上述作用。 第二部分:血管緊張素Ⅱ?qū)ρ芷交〖?xì)胞的影響 目的: 通過觀察AngⅡ?qū)﹄x體VSMC數(shù)量變化、粘附能力、遷移能力、增殖功能以及分泌功能的影響，并給予纈沙坦干預(yù)，以探

9、討AngⅡ在AS斑塊形成過程中對(duì)VSMC的作用，以及纈沙坦對(duì)AngⅡ的拮抗作用。 方法: 1、細(xì)胞原代培養(yǎng)：取新鮮臍帶15-20cm，將中膜平滑肌層剪成1-2m㎡的組織塊，進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用4-8代VSMC，實(shí)驗(yàn)前用無血清的DMEM培養(yǎng)液饑餓使細(xì)胞同步。 2、濃度效應(yīng)實(shí)驗(yàn)： 1）對(duì)照組：VSMC用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，不加特殊試劑； 2）不同濃度AngⅡ組：VSMC分別用含

10、不同濃度（10-7，10-6，10-5和10-4mol/L）的AngⅡ的0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h收集細(xì)胞 3）纈沙坦組：VSMC先在含纈沙坦（10-5 mol/L）的0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中孵育1h后，加入10-5mol/L的AngⅡ共同孵育48h，收集細(xì)胞。 3、時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)： VSMC在10-5mol/L的AngⅡ培養(yǎng)液中，分別培養(yǎng)0h、12h、24h、48h、72h后收集細(xì)胞，

11、進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定。 4、分別運(yùn)用計(jì)數(shù)法檢測(cè)各組VSMC的數(shù)量，貼壁法檢測(cè)粘附能力，Boyden小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞分泌能力（以Ⅰ型膠原與β-actin灰度比值代表Ⅰ型膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量）。 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，多組間均數(shù)比較以O(shè)N

12、E-Way ANOVA進(jìn)行，兩組間均數(shù)比較以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、AngⅡ在體外能呈濃度和時(shí)間依賴性地增加VSMC的數(shù)量。 2、AngⅡ在體外能改善VSMC的粘附、遷移、增殖能力，在一定的范圍內(nèi)這種作用呈濃度和時(shí)間依賴性。 3、AngⅡ在一定范圍內(nèi)呈濃度、時(shí)間依賴性刺激VSMCⅠ型膠原的mRNA的表達(dá)。 4、AngⅡ受體拮抗劑纈沙坦能夠抑制AngⅡ的上述各

13、種作用。 第三部分:血管緊張素Ⅱ?qū)S斑塊穩(wěn)定性作用機(jī)制的研究 目的: 通過觀察不同AngⅡ濃度以及不同AngⅡ作用時(shí)間對(duì)Ox-LDL刺激過的VSMC PAPP-A、MMP-9的分泌情況，并給予纈沙坦干預(yù)，以探討AngⅡ在AS斑塊形成與斑塊破裂中的作用機(jī)制，以及纈沙坦對(duì)AngⅡ的拮抗作用。 方法: 1、AngⅡ?qū)θ四歏SMC的影響。分組：1）對(duì)照組：VSMC用DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；2）無Ox-LD

14、L組：含AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；3）Ox-LDL組：Ox-LDL刺激6h，含AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)。 濃度效應(yīng)的研究：應(yīng)用不同終濃度（10-7mol/L，10-6moUL，10-5mol/L，104mol/L）的AngⅡ分別刺激2）組、3）組，24小時(shí)收集細(xì)胞。 時(shí)間效應(yīng)的研究：應(yīng)用10-5mol/L的AngⅡ分別刺激2）組、3）組，共同培養(yǎng)0h，6h，12h，24h，36h，48h后收集細(xì)胞。

15、2、纈沙坦對(duì)AngⅡ的干預(yù)作用 將VSMC用10-5mol/LOx-LDL及AngⅡ進(jìn)行孵育，并以纈沙坦進(jìn)行干預(yù)。分組：1）對(duì)照組：DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；2）Ox-LDL組：含終濃度為10-5mol/L的Ox-LDL的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；3）AngⅡ組：含終濃度分別為10-5mol/L的Ox-LDL與AngⅡ的DMEM全培養(yǎng)基培養(yǎng)；4）纈沙坦組：含終濃度分別為10-5mol/L的Ox-LDL、AngⅡ及纈沙坦的DMEM全培養(yǎng)基

16、培養(yǎng)。24小時(shí)后收集細(xì)胞和上清液，分別行RT-PCR及ELISA檢測(cè)。 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以x±s（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，相同樣本接受兩次以上的不同處理采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，多組間均數(shù)比較以O(shè)NE-Way ANOVA進(jìn)行，兩組間均數(shù)比較以獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論: 1、在高脂的環(huán)境中，AngⅡ可以誘導(dǎo)VSMC PAPP-A、I

17、GF-1的mRNA高度表達(dá)，并能增加PAPP-A、IGF-1蛋白的分泌，這種誘導(dǎo)作用在一定的范圍內(nèi)與AngⅡ存在劑量依賴性和作用時(shí)間依賴性。 2、在高脂的環(huán)境中，AngⅡ可以誘導(dǎo)VSMC MMP-9的mRNA高表達(dá)，并能增加PAPP-A蛋白的分泌，同時(shí)可以抑制VSMC TIMP-1 mRNA的表達(dá)，并能減少TIMP-1蛋白的分泌，這種誘導(dǎo)作用在一定的范圍內(nèi)與AngⅡ存在劑量劑量依賴性和作用時(shí)間依賴性。 3、AngⅡ受體拮