震波治療通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬減輕缺氧導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞損傷.pdf

1、盡管近年來(lái)針對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（簡(jiǎn)稱(chēng)冠心?。┑乃幬镏委煛⒔槿胫委?PCI)和外科手術(shù)治療(CABG)取得了很大進(jìn)展，仍有部分嚴(yán)重冠心病患者不能耐受PCI或CABG治療，或已經(jīng)接受以上治療后仍有心絞痛癥狀反復(fù)發(fā)作。這類(lèi)患者僅依賴(lài)單純的藥物治療，預(yù)后差，死亡率高。體外心臟震波治療是近年來(lái)針對(duì)嚴(yán)重冠心病患者的新的治療手段，目的是改善心肌供血和心臟功能。震波發(fā)揮心臟保護(hù)作用的機(jī)制尚不甚明確，可能包括促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的歸巢、刺激血管新生和抑

2、制氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化等。前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)震波治療可減輕缺血缺氧所致的心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟功能。自噬是真核細(xì)胞特有的、能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的損傷蛋白和細(xì)胞器進(jìn)行降解并重新利用的過(guò)程，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新，在多種應(yīng)激和疾病中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)自噬參與多種心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，但其究竟發(fā)揮正面或是負(fù)面作用，仍存在爭(zhēng)議。但有研究發(fā)現(xiàn)輕中度的缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬可能是保護(hù)性的，而震波

3、治療能否通過(guò)影響自噬發(fā)揮心臟保護(hù)作用，目前尚無(wú)相關(guān)研究數(shù)據(jù)。
　　研究目的:利用大鼠心肌細(xì)胞系H9c2(1)通過(guò)選擇合適的缺氧培養(yǎng)條件，建立心肌細(xì)胞體外缺血缺氧模型，探討缺氧時(shí)自噬發(fā)生的情況及其作用;(2)選擇作用于缺氧心肌細(xì)胞的震波治療所需合適能量;(3)探討震波治療在缺氧損傷中對(duì)心肌細(xì)胞自噬的影響和其發(fā)揮作用可能的信號(hào)通路。
　　研究方法:(1) H9c2細(xì)胞在填充有92％N2、5％CO2和3％O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定

4、的時(shí)間后，測(cè)定細(xì)胞活性和細(xì)胞內(nèi)ATP水平以評(píng)價(jià)細(xì)胞損傷的程度;Western blot法檢測(cè)LC3B的表達(dá)水平，用LC3B-Ⅰ/Ⅱ評(píng)價(jià)自噬發(fā)生的強(qiáng)度。選擇中等強(qiáng)度細(xì)胞損傷且自噬發(fā)生較強(qiáng)的缺氧培養(yǎng)時(shí)間。
　　(2)缺氧后，分別予細(xì)胞相對(duì)較低(0.02mJ/mm2)、中（0.05m J/mm2）和高（0.10mJ/mm2）三種強(qiáng)度的震波治療，測(cè)定細(xì)胞活力和LC3B表達(dá)情況，選擇對(duì)細(xì)胞活力和自噬強(qiáng)度影響最顯著的震波能量。
　　(3

5、)用MDC法對(duì)自噬小泡進(jìn)行染色，進(jìn)一步驗(yàn)證震波治療對(duì)缺氧心肌細(xì)胞自噬水平的影響;測(cè)定震波治療前后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化，探討震波治療對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的影響。
　　(4) Western blot的方法測(cè)定震波治療對(duì)自噬相關(guān)主要信號(hào)通路蛋白（AMPK、mTOR和Beclin-1等）和細(xì)胞存活相關(guān)蛋白（Sirt1和HIF-1α）的表達(dá)情況的影響。
　　研究結(jié)果:(1)缺氧處理后，H9c2細(xì)胞活力和ATP水平隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降

6、低，自缺氧6小時(shí)開(kāi)始，LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值開(kāi)始增強(qiáng)，24小時(shí)達(dá)高峰，此后隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，該比值逐漸呈下降趨勢(shì)。
　　(2)震波治療尤其是相對(duì)中等強(qiáng)度的震波(0.05 mJ/mm2)能夠顯著改善缺氧組的細(xì)胞活力，且使LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著升高，即缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平被進(jìn)一步增強(qiáng);而對(duì)照組的細(xì)胞活力在三種強(qiáng)度的震波治療前后均未見(jiàn)明顯變化，較低(0.02 mJ/mm2)或較強(qiáng)（0.10 mJ/mm2）能量的震波均

7、未對(duì)自噬水平產(chǎn)生有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響。
　　(3)缺氧24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)自噬小泡的熒光強(qiáng)度明顯較對(duì)照組增強(qiáng)，給予震波治療(0.05mJ/mm2)后熒光進(jìn)一步增強(qiáng)。檢測(cè)震波治療前后細(xì)胞內(nèi)ATP水平的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)震波治療后，缺氧所致的ATP水平下降可較前明顯回升。
　　(4)缺氧后，H9c2細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK、Beclin-1和HIF-1α表達(dá)上調(diào)，而磷酸化mTOR和Sirt1下調(diào)。震波治療可進(jìn)一步增強(qiáng)磷酸化AMPK的上調(diào)和磷酸化

8、mTOR的下調(diào)，增強(qiáng)Sirt1的表達(dá)增加，降低HIF-1α的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:(1)缺氧培養(yǎng)24小時(shí)能夠造成H9c2細(xì)胞損傷、功能障礙和死亡;
　　(2)缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞自噬上調(diào)，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值增加和細(xì)胞內(nèi)自噬小泡數(shù)量明顯增加;
　　(3)能量為0.05mJ/mm2的震波治療能夠進(jìn)一步提高缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬水平，減輕心肌細(xì)胞損傷，改善能量代謝，保護(hù)心肌細(xì)胞功能;
　　(4)震波治療可