p38MAPK在高血糖致大鼠微血管通透性增高過程中的作用.pdf

1、實驗目的：目前，無論是1型還是2型糖尿病，高血糖的毒性作用已被公認為是血管并發(fā)癥的主要致病因素。而在糖尿病病程發(fā)生發(fā)展過程中，血管通透性的增高是糖尿病血管并發(fā)癥的一個標志性事件，是其發(fā)生的最初表現(xiàn)和導致其他后續(xù)改變的病理基礎(chǔ)，所以研究高血糖致微血管通透性增高的機制就成為一個很有意義的工作。本課題以SD大鼠為研究對象，通過復制糖尿病模型，利用在體腸系膜微血管通透性的測定，腸系膜微血管骨架蛋白染色等手段，研究p38MAPK(p38mitog

2、en-activatedproteinkinase，p38MAPK)信號傳導通路在糖尿病大鼠微血管內(nèi)皮細胞通透性增高中的作用機理。我們通過上述研究試圖闡明p38MAPK在高血糖致微血管內(nèi)皮細胞通透性增高過程中的作用，探討高血糖致微血管通透性增高的發(fā)生機制，并為糖尿病諸多慢性并發(fā)癥的診治提供新的思路和理論依據(jù)。 實驗方法： 1.實驗分組 符合國家實驗動物標準的SPF級SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠60

3、只，體重180-200g，由第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。健康雄性SD大鼠隨機分成5組：(1)正常組(normal)：健康大鼠，與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)。(2)糖尿病組(Diabetesmilltus，DM)：(3)溶劑對照組(control)：健康大鼠腹腔注射相同容量的STZ溶劑，與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)。(4)DM+MKK6b(A)組：糖尿病模型大鼠實驗前24h尾靜脈注射p38上游激酶MKK6b的無活性誘變體[MKK6b(A)]2.5m

4、l/kg。(5)MKK6b(E)組：與造模大鼠同條件下飼養(yǎng)健康大鼠，實驗前24h尾靜脈注射p38上游激酶MKK6b的活性誘變體[MKK6b(E)]2.5ml/kg。 2.糖尿病大鼠模型的制備 健康雄性SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素55mg/kg，分別在72h、一個月斷尾尖采血檢測血糖，其值均大于16.7mmol/L為造模成功。血糖檢測用羅氏公司生產(chǎn)樂全康2血糖檢測儀及其配套的樂全康系列血糖試紙。 3.腸系膜微血管內(nèi)皮

5、細胞骨架蛋白的觀察 各組SD大鼠用0.5％戊巴比妥鈉6ml/kg麻醉，打開腹腔，迅速取血管豐富段腸系膜，置于磷酸鹽緩沖液(PBS)，在立體顯微鏡下分離微靜脈，游離的微靜脈用PBS漂洗2min×3次，然后用4％甲醛溶液固定10min，PBS漂洗2min×3次，再用0.5％TritonX-100液處理15分鐘，PBS漂洗2min×3次，最后用2U/ml的羅丹明-鬼筆環(huán)肽室溫避光孵育1h，PBS漂洗2min×3次。染色結(jié)束后在激光共聚

6、焦顯微鏡下觀察并掃描記錄微血管內(nèi)皮細胞骨架圖片(放大1000倍，油鏡)。 4.在體大鼠腸系膜微血管通透性的檢測 SD大鼠用05％戊巴比妥鈉6ml/kg麻醉后行股動、靜脈插管術(shù)，其中動脈插管連接電子血壓計，大鼠平均動脈壓穩(wěn)定在105-125mmHg之間；剖腹并將腸系膜暴露于倒置熒光顯微鏡下，腸系膜局部溫度保持37℃。股靜脈注射5mg/L熒光標記白蛋白(Albumin，F(xiàn)luoresceinisothiocyanate，F(xiàn)I

7、TC-albumin)50ml/kg，10min內(nèi)流經(jīng)或透出直徑為30±3μm的微靜脈血管熒光白蛋白的強度變化情況由攝像機記錄并輸入計算機存檔。用圖像分析軟件計算一定時間內(nèi)血管內(nèi)外熒光強度，而反映微血管通透性的Pa值用血管內(nèi)外熒光強度比值的變化速率來表示，每只大鼠測三次，取平均值。 實驗結(jié)果 1.高血糖所致微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的改變 正常組腸系膜微靜脈的內(nèi)皮細胞骨架蛋白染色結(jié)果顯示，F(xiàn)-actin主要分布在細胞

8、周邊，線條清晰完整連續(xù)，整根血管顯示出內(nèi)皮細胞網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。糖尿病組微血管的血管內(nèi)皮骨架形態(tài)不再完整，細胞骨架蛋白網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)已經(jīng)離散，提示高血糖時腸系膜微血管內(nèi)皮骨架形態(tài)發(fā)生的改變。 2.抑制p38MAPK激活后對微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的影響 p38上游激酶MKK6b的無活性誘變體MKK6b(A)處理糖尿病大鼠，抑制了p38MAPK的激活后，腸系膜微靜脈內(nèi)皮細胞的骨架蛋白正常網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)得到恢復。 3.直接激活p38M

9、APK激活后對微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白的影響 p38上游激酶MKK6b的活性誘變體MKK6b(E)處理正常大鼠，直接激活了p38MAPK后，腸系膜微靜脈內(nèi)皮細胞的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)基本消失，細胞骨架形態(tài)凌亂。 4.糖尿病大鼠血管通透性的改變和p38MAPK的作用 本實驗檢測數(shù)據(jù)顯示，糖尿病組大鼠腸系膜微血管通透性比正常組和溶劑組對照組都有了顯著性增高(p＜0.05)，用p38上游激酶MKK6b的活性誘變體MKK6b(E)處

10、理的MKK6b(E)組大鼠，腸系膜微靜脈通透性也是顯著增高(p＜0.05)，而用無活性誘變體MKK6b(A)處理的MKK6b(A)組大鼠比糖尿病組腸系膜微靜脈通透性明顯降低(p＜0.05)，而與正常組和溶劑對照組則都沒有顯著性統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。 實驗結(jié)論： 1.高血糖可以使微血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白發(fā)生形態(tài)學變化，并且可以導致微血管的通透性增高。 2.用MKK6b(E)直接激活p38MAPK信號通路可以使微

11、血管內(nèi)皮細胞骨架蛋白形態(tài)學發(fā)生變化，并且能增高大鼠微血管的通透性。用MKK6b(A)抑制了p38MAPK信號通路可以改善高血糖所致微靜脈內(nèi)皮細胞骨架蛋白改變，并能抑制高血糖所致微靜脈的高通透性。 3.糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，由于高血糖事件的發(fā)生，p38MAPK被激活，經(jīng)過復雜的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導機制，作用于細胞骨架蛋白，引起F—actin的重組和再分布，導致細胞骨架破壞，細胞間隙增大并影響細胞間連接的結(jié)構(gòu)和功能完整性，最終導致血管的