急性高氧氧應(yīng)激過(guò)程中大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡的損傷機(jī)制探討.pdf

1、目的：建立高濃度氧誘導(dǎo)在體大鼠肺泡細(xì)胞凋亡損傷模型，觀察短時(shí)間內(nèi)(4～8小時(shí))吸入高濃度氧肺泡上皮細(xì)胞的損傷；觀察一氧化氮及其合酶對(duì)急性吸入高濃度氧導(dǎo)致大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡的影響；探討線粒體途徑和細(xì)胞酸化在氧化應(yīng)激早期誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的作用。
　　 方法：WISTAR大鼠放至于氧濃度為80-100％的氧箱中4、8、12、16小時(shí)，空氣對(duì)照組放置于氧濃度為21％的氧箱中，實(shí)驗(yàn)分三部分，按實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌迫颖咀鋈?/p>

2、下測(cè)試：1．比色法測(cè)定血漿、肺組織勻漿中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽(GSH)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和總抗氧化能力(T-AOC)；胍染色觀察肺組織常規(guī)病理變化，TUNEL染色法檢測(cè)肺泡表面凋亡細(xì)胞；2．Westernblot檢測(cè)肺組織中eNOS和iNOS蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達(dá)。3．RT-PCR檢測(cè)bcl-2mRNA、baxmRN

3、A、eNOSmRNA、iNOSmRNA的表達(dá)，Westernblot檢測(cè)bcl-2、bax、Akt1/磷酸化-Akt1、mTOR/磷酸化-mTOR的蛋白表達(dá)；BCECF-AM檢測(cè)細(xì)胞漿pH值，流式細(xì)胞儀(Flowcytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)細(xì)胞增殖指數(shù)。
　　 結(jié)果：1．與對(duì)照組相比（凋亡2.17％），吸入高濃度氧4小時(shí)即出現(xiàn)典型的肺泡表面凋亡細(xì)胞(9.13±3.2％)，8～12小時(shí)組凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增加(17.47±3.

4、5％、19.22±4.5％)，16小時(shí)組有減少的趨勢(shì)(11.03±2.8％)。HE染色切片顯示4小時(shí)組肺輕度充血，8小時(shí)組肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血、紅細(xì)胞滲出、輕度肺水腫。16小時(shí)組開始出現(xiàn)以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞，肺組織水腫明顯、肺大泡和肺不張，甚至可見肺組織增生、結(jié)構(gòu)紊亂。各組血清、肺組織勻漿MDA、NO、NOS顯著升高(P＜0.01)，而SOD、GSH、CAT、T-AOC均顯著降低(P＜0.01)。2．Westenblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，

5、高氧4h組eNOS表達(dá)開始升高，8h、12h組后eNOS蛋白質(zhì)表達(dá)升高明顯，16h組高表達(dá)但略有下降；高氧各組eNOSmRNA表達(dá)顯著增高。對(duì)照組iNOS蛋白微量表達(dá)，與對(duì)照組比較,4h、8h、12h組表達(dá)無(wú)顯著差異，表達(dá)量遠(yuǎn)低于eNOS，16h組表達(dá)略增強(qiáng)；iNOSmRNA的表達(dá)在16h組表達(dá)也增強(qiáng)。3．RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)吸氧各組bcl-2mRNA表達(dá)明顯降低，baxmRNA表達(dá)顯著增高；Westernblot檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)逐漸

6、增強(qiáng)，Bcl-2蛋白、AKT-1/PhosphoAkt-1(Ser473)蛋白、mTOR/Phospho-mTOR蛋白表達(dá)逐漸減弱；高氧氧應(yīng)激后大鼠肺泡上皮細(xì)胞Akt/PKB蛋白磷酸化程度都降低，隨吸氧時(shí)間延長(zhǎng)，Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白表達(dá)降低更加明顯；BCECF-AM檢測(cè)細(xì)胞漿pH值顯示隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)，體內(nèi)ROS水平的不斷升高，F(xiàn)L1/FL2比值不斷降低，凋亡的比例也不斷增加。各時(shí)段細(xì)胞酸化均較顯著，各組細(xì)胞增殖改變和細(xì)胞漿酸

7、性變化趨勢(shì)相一致。
　　 結(jié)論：1．大鼠活體急性高氧氧應(yīng)激模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間吸入高濃度氧導(dǎo)致急性氧應(yīng)激時(shí)即可導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞凋亡顯著增加，且隨著吸氧時(shí)間的延長(zhǎng)損傷加重，損傷轉(zhuǎn)為向炎癥表現(xiàn)發(fā)展。2．氧應(yīng)激凋亡早期(4-8h)NO大幅升高由eNOS表達(dá)增強(qiáng)引起的。16hiNOS和iNOSmRNA表達(dá)略增強(qiáng)，但并不高，炎性表現(xiàn)不明顯，說(shuō)明炎性細(xì)胞功能還未被完全激活。3．線粒體膜通透性改變和線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔道的開放，BCL-2/BA

8、X減小，AKT/mTOR及其磷酸化表達(dá)均減少，導(dǎo)致PI3/Akt/mTOR信號(hào)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，說(shuō)明了高氧氧應(yīng)激早期線粒體途徑應(yīng)是肺泡上皮細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)傳導(dǎo)路徑。4。高氧氧應(yīng)激后ROS同時(shí)損傷了溶酶體膜的穩(wěn)定性，溶酶體內(nèi)活性物質(zhì)的釋放導(dǎo)致線粒體損傷更加嚴(yán)重，促使溶酶體參與的線粒體途徑的細(xì)胞凋亡機(jī)制的發(fā)生。但這種早期損傷還尚未啟動(dòng)其他如自噬等炎性生理反應(yīng)，僅凋亡現(xiàn)象表現(xiàn)的非常明顯。5．通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察提示氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞凋亡與細(xì)胞漿酸

9、化有關(guān)，ROS通過(guò)直接損傷了細(xì)胞質(zhì)膜抑制Na+/H+交換使細(xì)胞內(nèi)酸化，或者損傷溶酶體膜，釋放大量H+進(jìn)入細(xì)胞漿，導(dǎo)致細(xì)胞酸化，這有利于細(xì)胞內(nèi)酸性核酸內(nèi)切酶等生物活性物質(zhì)發(fā)揮作用，誘導(dǎo)凋亡。細(xì)胞漿酸化程度與細(xì)胞凋亡發(fā)生率存在某種量效關(guān)系，細(xì)胞酸化既可能是細(xì)胞凋亡的伴隨現(xiàn)象，同時(shí)又可能導(dǎo)致線粒體、溶酶體損傷，加重線粒體始酶體途徑引起的細(xì)胞死亡，其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)利用大鼠在體活細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，吸入氧濃度與臨床全麻使用氧濃