DNA聚合酶βR137Q突變影響小鼠胚胎發(fā)育的研究.pdf

1、脫氧核糖核酸(DNA)是生命遺傳信息的載體。DNA分子的完整性和穩(wěn)定性對于細(xì)胞的存活和正常的生命活動具有重要意義。DNA聚合酶β(Polβ)是堿基切除修復(fù)途徑中的關(guān)鍵酶，在維持基因穩(wěn)定性和完整性的過程中起著重要作用。PolβR137Q位點(diǎn)是將Polβ的第137位精氨酸替換成谷氨酰胺，實(shí)驗(yàn)室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變會降低DNA堿基切除修復(fù)效率，而降低DNA堿基切除修復(fù)效率的分子機(jī)制目前還不清楚。
　　本研究通過經(jīng)典的基因打靶的方法

2、成功獲取了R137Q突變的轉(zhuǎn)基因小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，R137Q突變的純合小鼠的出生率顯著低于野生型對照小鼠，對孕鼠進(jìn)行解剖后發(fā)現(xiàn)，R137Q小鼠E15.5，E17.5和E19.5天的胚胎體型和體重都顯著低于野生型小鼠胚胎。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明，R137Q小鼠胚胎增殖顯著低于野生型小鼠。胚胎成纖維細(xì)胞(MEFs)的細(xì)胞生長曲線進(jìn)一步證實(shí)了免疫組化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。對磷酸化細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白pCHK1進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，pCHK1在R137Q細(xì)胞中的表達(dá)量顯

3、著高于對照組，表明R137Q細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)被激活。同時，TUNEL凋亡測定發(fā)現(xiàn)，R137Q細(xì)胞存在更高的凋亡比例。
　　R137Q細(xì)胞增殖較慢并且凋亡增加同時細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)被激活，而只有當(dāng)細(xì)胞周期異常時檢驗(yàn)點(diǎn)才會被激活，基于此我們觀察DNA結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化。通過核型分析發(fā)現(xiàn)，R137Q細(xì)胞內(nèi)存在更多的染色體斷裂?？紤]到Polβ是堿基切除修復(fù)中的關(guān)鍵酶，Polβ位點(diǎn)突變可能會影響DNA堿基切除修復(fù)能力。于是采用組織裂解液和原代胚胎成

4、纖維細(xì)胞裂解液來重構(gòu)短片段堿基切除修復(fù)(SP-BER)和長片段堿基切除修復(fù)(LP-BER)過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與WT相比，R137Q小鼠的組織和細(xì)胞裂解液均不能有效修復(fù)DNA損傷，R137Q細(xì)胞BER修復(fù)效率明顯降低，提示細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)出現(xiàn)障礙。伴隨著R137Q細(xì)胞堿基切除修復(fù)效率的降低，細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)時產(chǎn)生大量的DNA中間產(chǎn)物如DNA斷裂，免疫印跡和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示R137Q細(xì)胞存在著更多的DNA雙鏈斷裂。之前體外

5、的研究已經(jīng)表明，R137位點(diǎn)的突變導(dǎo)致了Polβ聚合酶活性的降低和堿基切除修復(fù)效率的下降。該結(jié)果表明體內(nèi)的R137Q突變影響了聚合酶活性和堿基切除效率，進(jìn)而導(dǎo)致了DNA雙鏈斷裂和染色體異常。
　　此外，通過烷化劑和氧化劑處理細(xì)胞來模擬正常生理?xiàng)l件下細(xì)胞所受的各類DNA損傷刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用MMS和雙氧水分別處理純合子的R137QMEFs，雜合子WT/R137Q MEFs和野生型WT MEFs之后，R137Q純合子MEFs的生存率

6、大大降低，磷酸化的組蛋白H2AX表達(dá)量顯著增加，這一結(jié)果表明，R137Q突變增加了細(xì)胞對DNA損傷試劑的敏感性，誘發(fā)了更多的DNA損傷。
　　綜上，實(shí)驗(yàn)通過R137Q的轉(zhuǎn)基因小鼠，用體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，R137是Polβ的關(guān)鍵位點(diǎn)，R突變成Q導(dǎo)致了Polβ功能受損，DNA修復(fù)能力下降以及基因組的不穩(wěn)定，最終引起了細(xì)胞和小鼠整體的生理功能異常。我們的結(jié)果再次證實(shí)了Polβ結(jié)構(gòu)和功能的完整性對于維持生物體正常生命活動的重要作用。本研究