腎間質(zhì)纖維化的“濁毒致瘀”病機(jī)學(xué)說(shuō)及益氣化瘀解毒中藥保護(hù)作用的研究.pdf

1、目的：慢性腎臟病(CKD)在我國(guó)疾病譜中長(zhǎng)期占據(jù)著主要的位置，嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康質(zhì)量。而各類(lèi)慢性腎臟病進(jìn)展中均可見(jiàn)腎間質(zhì)纖維化。當(dāng)前大量的臨床及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎間質(zhì)纖維化程度與患者腎功能及預(yù)后密切相關(guān)。因此及時(shí)有效地減少間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕其導(dǎo)致的炎性反應(yīng)，防止間質(zhì)纖維化的發(fā)生與發(fā)展，這是延緩腎功能向惡化的方向進(jìn)展，改善患者預(yù)后的重要手段。
　　腎間質(zhì)纖維化的形成過(guò)程中腎間質(zhì)炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、炎癥性反應(yīng)、腎小管足細(xì)胞受損、表型轉(zhuǎn)化

2、，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的活化與增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積可導(dǎo)致間質(zhì)瘢痕硬化的形成。而這其中炎性損傷誘導(dǎo)細(xì)胞增殖在腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展中起著重要作用。
　　在前期研究化瘀滌痰通絡(luò)中藥調(diào)控腎上腺髓質(zhì)素(Adrenomendullin, ADM)抑制細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)對(duì)于腎間質(zhì)纖維化病變，單純抑制細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化尚難以減緩疾病的進(jìn)展，而炎性損傷誘導(dǎo)細(xì)胞增殖在纖維化的形成中發(fā)揮著重要作用。結(jié)合腎病后期脾腎虧虛、濕濁毒邪內(nèi)蘊(yùn)的病機(jī)學(xué)說(shuō)和“久病

3、入絡(luò)”的理論，發(fā)現(xiàn)梗阻性腎病存在明顯的炎性損傷和細(xì)胞增殖，基于慢性腎病后期多見(jiàn)“脾腎虧虛，濕濁毒邪內(nèi)蘊(yùn)”和“久病入絡(luò)”的病機(jī)，因而提出“濁毒致瘀”的假說(shuō)。
　　本研究以單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)的方法誘導(dǎo)醛固酮活化—炎性介質(zhì)高表達(dá)—信號(hào)轉(zhuǎn)錄—細(xì)胞增殖—細(xì)胞外基質(zhì)積聚為路徑，結(jié)扎野生型(Wide Type,WT)小鼠和ADM基因敲除小鼠單側(cè)輸尿管以復(fù)制腎間質(zhì)纖維化模型，同

4、時(shí)給予依普利酮和益氣化瘀解毒中藥湯劑進(jìn)行研究性治療，觀察梗阻因素誘導(dǎo)醛固酮活化通過(guò) SGK-1/NF-кB信號(hào)通路誘導(dǎo)纖維化進(jìn)展，以及影響 MAPK通路中蛋白激酶 ERK(extracellular regulated protein kinases)的磷酸化，使得核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，刺激細(xì)胞增殖并分泌過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)形成纖維化的病理改變，以探討炎性介質(zhì)(濁毒)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖形成纖維化(瘀)的機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)途徑。同時(shí)觀察ADM對(duì)細(xì)胞

5、增殖的影響以及益氣化瘀解毒中藥的調(diào)控靶點(diǎn)，為“濁毒致瘀”假說(shuō)的提出及益氣化瘀解毒中藥的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分腎間質(zhì)纖維化的“濁毒致瘀”病機(jī)學(xué)說(shuō)的提出及益氣化瘀解毒中藥的保護(hù)作用
　　方法：根據(jù)有腎間質(zhì)纖維化的多種腎臟慢性疾病進(jìn)行到后期共同的病理過(guò)程，病癥表現(xiàn)與相應(yīng)的中醫(yī)病癥的范疇匹配，查閱古代醫(yī)籍文獻(xiàn)，結(jié)合中醫(yī)理論、現(xiàn)代中藥藥理研究與長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，總結(jié)、提煉“濁毒致瘀”的實(shí)驗(yàn)、臨床與治療依據(jù)，以及中醫(yī)藥在治療腎

6、間質(zhì)纖維化的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用方面的主要作用。將64例難治性腎病綜合征患者分為治療組和對(duì)照組各32例，對(duì)照組按照強(qiáng)的松標(biāo)準(zhǔn)療程給予；治療組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加服益氣化瘀解毒中藥，持續(xù)半年以上。兩組患者在治療結(jié)束后分別觀察觀察療效、24h尿蛋白定量(URPO)、血清白蛋白(ALB)、總膽固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)血纖維蛋白原(FIB)及部分凝血酶原時(shí)間(APTT)的變化。
　　結(jié)果：總結(jié)并提出了腎間質(zhì)纖維化的“濁毒致瘀”病機(jī)學(xué)說(shuō)

7、，同時(shí)針對(duì)“濁毒致瘀”的病機(jī)，確立益氣化瘀解毒治法，在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中初識(shí)益氣化瘀解毒中藥對(duì)于腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用機(jī)制。兩組治療前后自身比較，治療組24h尿蛋白、膽固醇、甘油三酯及血纖維蛋白原較治療前顯著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時(shí)間較治療前明顯升高（P<0.05）；對(duì)照組24h尿蛋白、膽固醇及血纖維蛋白原較治療前顯著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時(shí)間較治療前明顯升高（P<0.05）；兩組治

8、療后比較，治療組24h尿蛋白、膽固醇、甘油三酯及血纖維蛋白原較對(duì)照組顯著降低(P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原時(shí)間較對(duì)照組明顯升高（P<0.05）。
　　第二部分腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠的繁殖與鑒定
　　方法：選用 C57BL/6純系雌性野生小鼠和腎上腺髓質(zhì)素基因敲除小鼠按照SPF(無(wú)特定病原體)級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng)。適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將1只雄鼠和2只雌鼠合籠進(jìn)行繁殖。雜交繁殖后經(jīng)基因鑒定篩選出的三個(gè)月齡雄性腎上

9、腺髓質(zhì)素基因敲除雜合子小鼠與純系雌性野生小鼠合籠，待實(shí)驗(yàn)小鼠成熟后分組繁殖，雌性小鼠一旦懷孕立即記錄父系來(lái)源并分籠。提取小鼠尾部組織DNA基因組，通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，而后進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳，以鑒定并篩選出本實(shí)驗(yàn)所用ADM基因敲除小鼠。
　　結(jié)果：小鼠尾部組織瓊脂糖凝膠電泳基因型片段顯示ADM基因敲除小鼠基因型雜合子(+/-)為雙道，按此類(lèi)基因條帶可以鑒別出腎上腺髓質(zhì)素(ADM)基因敲除小鼠。
　　第三部分益氣化瘀解毒中藥

10、對(duì)野生型和ADM基因敲除型腎間質(zhì)纖維化小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)、醛固酮及細(xì)胞增殖的影響
　　方法：野生型(WT)及ADM基因敲除型(AMKO)小鼠全部采取隨機(jī)分組， WT型小鼠四組分別為假手術(shù)組(WT-Sham group)、模型組(WT-UUO group)、依普利酮組(WT-UUOE group)及中藥治療組(WT-UUOZ group)四組；AMKO型小鼠四組分別為假手術(shù)組(AMKO-Sham group)、模型組(AMKO-UU

11、O group)、依普利酮組(AMKO-UUOE group)及中藥治療組(AMKO-UUOZ group)四組。以上各組僅假手術(shù)組采用切開(kāi)并游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎的方法，其余的各組則施以左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。兩中藥治療組給予益氣化瘀解毒中藥湯劑(黃芪20g、丹參20g、醋鱉甲、僵蠶、烏梢蛇、地龍、赤芍、黃芩、金銀花、蒲公英、大黃各10g，以上藥物按照成人一日劑量50kg體重一日用量折算)6.5g/kg?d以口灌服；兩個(gè)依普利酮治療組則采用

12、依普利酮混勻于飼料后按照100mg/kg?d劑量進(jìn)食。兩假手術(shù)組和兩模型組通過(guò)經(jīng)口灌服與中藥治療組中藥湯劑等劑量的生理鹽水。連續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)各組小鼠的一般情況，給藥持續(xù)10天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用小鼠眼球摘除取血，在使用離心機(jī)分離血清后，分別測(cè)定小鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、醛固酮(Ald)；摘取左側(cè)腎臟，進(jìn)行腎臟組織HE、MASSON染色，觀察組織病理學(xué)改變；采用免疫組化法檢測(cè)各組小鼠腎臟中PCNA的表達(dá)。
　　以上數(shù)據(jù)資

13、料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±S.D.)表示，使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用單因素方差分析(ANOVA)和卡方檢驗(yàn)(Chi-square test)分析。差異水平以0.05和0.01做為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：
　　1實(shí)驗(yàn)小鼠一般情況觀察結(jié)果
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩假手術(shù)組小鼠飲食飲水情況與其余各組無(wú)明顯異常，手術(shù)切口均愈合良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，摘取各組小鼠左側(cè)腎臟，觀察顯示兩假手術(shù)組小鼠腎臟形態(tài)顏色均與正常小鼠一致

14、，兩模型組可見(jiàn)腎臟體積明顯增大伴有積水，顏色由正常的鮮紅色變?yōu)辄S色，甚則暗褐色：兩依普利酮組和中藥組腎臟體積也有增大，但較模型組相對(duì)較小，積水量少，顏色呈現(xiàn)暗紅色。
　　2小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　HE染色顯示，兩型小鼠的假手術(shù)組均未觀察到明顯的異常。WT和AMKO兩型小鼠模型組可見(jiàn)明顯的腎小管上皮細(xì)胞的水腫，變性壞死以及缺失，有的萎縮程度較甚，在腎間質(zhì)區(qū)可觀察到有大量的炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，ADM基因敲除小鼠模型組尤甚。

15、兩型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組的病理?yè)p傷程度與模型組比較減輕，同時(shí)可見(jiàn)基因敲除小鼠損傷重于野生小鼠。Masson染色結(jié)果可見(jiàn)，WT小鼠與AMKO小鼠的假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)基本正常，僅有少量膠原成分出現(xiàn)于腎間質(zhì)，腎小管的基底膜具有較好的完整性。WT和AMKO小鼠模型組的腎臟結(jié)構(gòu)被破壞，腎小管基底膜嚴(yán)重變薄，同時(shí)可見(jiàn)有部分小管呈現(xiàn)出擴(kuò)張現(xiàn)象，膠原成分以條帶樣或灶狀大量沉積于腎間質(zhì)，AMKO型小鼠的損傷重于WT型小鼠。兩型小鼠的依普利酮治療

16、組及中藥治療組腎間質(zhì)膠原成分的聚集較模型組均有明顯減輕的趨勢(shì)。
　　3腎功能檢測(cè)結(jié)果
　　BUN檢測(cè)結(jié)果顯示，野生小鼠與 ADM基因敲除小鼠模型組與同類(lèi)型小鼠假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類(lèi)型小鼠模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。Scr檢測(cè)結(jié)果顯示，野生小鼠與ADM基因敲

17、除小鼠模型組與同類(lèi)型小鼠假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類(lèi)型小鼠模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　4醛固酮檢測(cè)結(jié)果
　　Ald檢測(cè)結(jié)果顯示，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠模型組與同類(lèi)型小鼠假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治

18、療組和中藥治療組與同類(lèi)型小鼠模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠依普利酮組與ADM基因敲除小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　5對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　PCNA檢測(cè)結(jié)果顯示，在假手術(shù)組的小鼠腎小管上皮細(xì)胞中觀察到極少數(shù)目的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞，而在UUO小鼠的遠(yuǎn)端腎小管其表達(dá)顯著增加。與UUO小鼠相比，PCNA陽(yáng)性細(xì)胞在兩個(gè)依

19、普利酮治療組及中藥組中均減少。與WT小鼠相比，陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目在ADM基因敲除小鼠的模型組、依普利酮處理組及中藥組中明顯增加。其中，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠模型組與同類(lèi)型小鼠假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠與ADM基因敲除小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組與同類(lèi)型小鼠模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，野生小鼠依普利酮組與ADM基因敲除小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，野生小鼠中藥治療組與ADM基因敲除

20、小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　第四部分益氣化瘀解毒中藥對(duì)野生型和ADM基因敲除型腎間質(zhì)纖維化小鼠SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的影響
　　方法：動(dòng)物分組情況、模型制作及給藥方法與第二部分相同，實(shí)驗(yàn)過(guò)程共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后摘取小鼠的左側(cè)腎臟，采用Western-Blot和免疫組化法對(duì)各組小鼠腎臟SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方

21、法同第二部分。
　　結(jié)果：
　　1 Western Blot檢測(cè)SGK-1、NF-кB、ERK、P-ERK及ADM的表達(dá)
　　1.1 Western Blot檢測(cè)SGK-1的表達(dá)
　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)SGK-1蛋白表達(dá)情況，半定量結(jié)果顯示，野生及 ADM基因敲除兩假手術(shù)組小鼠腎組織 SGK-1有表達(dá)極少，兩模型組表達(dá)明顯高于同型小鼠的假手術(shù)組(P＜0.05)，AMKO模型組的表達(dá)高于WT小鼠模型組

22、(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組相較于同型小鼠模型組降低顯著(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠中藥治療組和依普利酮治療組與WT型小鼠兩處理組間無(wú)明顯差異(P均>0.05)。
　　1.2 Western Blot檢測(cè)NF-кB的表達(dá)
　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)NF-кB蛋白表達(dá)情況，半定量結(jié)果顯示，WT及AMKO兩型假手術(shù)組小鼠腎組織NF-кB表達(dá)量極少

23、，兩型小鼠的模型組表達(dá)增強(qiáng)，較同型假手術(shù)組明顯升高(P＜0.05)，AMKO模型組 NF-кB的表達(dá)高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組和兩中藥治療組均低于同型小鼠的模型組(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥治療組和依普利酮治療組與WT型小鼠的兩處理組存在明顯差異(P均＜0.05)。
　　1.3 Western Blot檢測(cè)P-ERK的表達(dá)
　　應(yīng)用Wes

24、tern Blot檢測(cè)P-ERK蛋白表達(dá)情況，半定量結(jié)果顯示，WT及AMKO假手術(shù)組小鼠的P-ERK表達(dá)量極少，WT和AMKO小鼠的模型組表達(dá)增強(qiáng)，顯著高于同種類(lèi)型小鼠的假手術(shù)組(P＜0.05)，同時(shí)可見(jiàn)到AMKO的模型組高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠的依普利酮治療組及兩中藥治療組P-ERK的表達(dá)低于同類(lèi)型的小鼠模型組(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥治療組和依普利酮治療

25、組與 WT型小鼠兩處理組間存在明顯差異(P均＜0.05)。
　　1.4 Western Blot檢測(cè)P-ERK/ERK的表達(dá)
　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)ERK蛋白表達(dá)情況，后將P-ERK與ERK進(jìn)行比值處理，結(jié)果顯示W(wǎng)T及AMKO小鼠P-ERK/ERK在模型組中上升，明顯高于同類(lèi)型小鼠的假手術(shù)組(P＜0.05)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)AMKO小鼠模型組高于WT小鼠模型組(P＜0.05)。兩型小鼠依普利酮治療組和中藥治療組則低于同

26、種類(lèi)型小鼠的模型組(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同種處理方法組間比較，AMKO型小鼠的中藥組和依普利酮組與WT型小鼠兩處理組不存在明顯差異(P均>0.05)。
　　1.5 Western Blot檢測(cè)ADM的表達(dá)
　　應(yīng)用Western Blot檢測(cè)ADM蛋白表達(dá)情況，半定量結(jié)果顯示，野生及ADM基因敲除兩假手術(shù)組小鼠腎組織ADM蛋白大量表達(dá)，兩模型組表達(dá)顯著低于同型假手術(shù)組(均有 P＜0.01)，同時(shí)可見(jiàn) A

27、DM基因敲除模型組低于野生小鼠模型組(P＜0.05)。野生假手術(shù)組明顯高于ADM基因敲除假手術(shù)組(P＜0.05)，兩型小鼠的依普利酮治療組和中藥治療組明顯高于同類(lèi)型模型組(P＜0.05)。WT及AMKO小鼠同型之間中藥組與依普利酮組不存在差異(P均>0.05)。WT小鼠依普利酮組與 AMKO小鼠依普利酮治療組比較有差異(P<0.05)，WT小鼠中藥治療組與AMKO小鼠的中藥治療組比較有差異(P<0.05)。
　　2免疫組化檢測(cè)SG

28、K-1、NF-кB及P-ERK的表達(dá)
　　2.1免疫組化檢測(cè)SGK-1的表達(dá)
　　光鏡觀察結(jié)果顯示，WT及AMKO假手術(shù)組小鼠的SGK-1基本無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，在腎小球、小管和間質(zhì)部無(wú)表達(dá)；兩型小鼠的模型組中 SGK-1在集合管的上皮細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)增多的趨勢(shì)，有些腎小管的上皮細(xì)胞以及周?chē)拈g質(zhì)區(qū)域中SGK-1表達(dá)顯著，AMKO模型組表達(dá)尤其明顯。兩型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組SGK-1表達(dá)較同型模型組明顯減少。
　　2

29、.2免疫組化檢測(cè)NF-кB的表達(dá)
　　光鏡下WT及AMKO假手術(shù)組小鼠陽(yáng)性表達(dá)基本不可見(jiàn)，在腎小球、小管及間質(zhì)部亦無(wú)表達(dá)；WT和AMKO兩型小鼠的模型組中NF-кB在腎皮質(zhì)的近端小管的細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)出現(xiàn)明顯的增多，其中尤其以AMKO模型組表達(dá)較為明顯。兩類(lèi)型小鼠的依普利酮治療組及中藥治療組 NF-кB表達(dá)較同型模型組明顯減少。
　　2.3免疫組化檢測(cè)P-ERK的表達(dá)
　　WT和AMKO假手術(shù)組小鼠P-ERK極少表達(dá)，僅存

30、在于腎小球和小管處；WT及AMKO模型組的表達(dá)可見(jiàn)于腎小管的上皮細(xì)胞，髓質(zhì)區(qū)表達(dá)明顯增強(qiáng)，ADM基因敲除小鼠尤其明顯；WT和AMKO的依普利酮治療組與中藥治療組的表達(dá)相對(duì)于同類(lèi)型小鼠的模型組顯著減少。但兩組中ADM基因敲除小鼠較野生小鼠損傷更為嚴(yán)重。
　　結(jié)論：
　　1“濁毒致瘀”是慢性腎臟病的重要病機(jī)。
　　2 梗阻性腎病可激活醛固酮，誘導(dǎo)炎癥損傷，刺激細(xì)胞增殖，參與腎間質(zhì)纖維化。
　　3 ADM參與腎間質(zhì)纖維