SD大鼠螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)觀察.pdf

1、目的：SD大鼠原代螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Spiral ganglion cells，SGC)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)間接共培養(yǎng)，觀察BMSCs是否誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞，并觀察其對(duì)SGCs生長(zhǎng)影響，為治療感音神經(jīng)性耳聾治療尋求新的治療方法。
　　 方法：
　　 1.BMSCs的原代及傳代培養(yǎng):SD大鼠全骨髓直接貼壁法培養(yǎng)BMSCs并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第3代

2、細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)及免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
　　 2.SGCs的原代培養(yǎng)，取新生SD大鼠進(jìn)行離體SGCs離體培養(yǎng)，取第3天細(xì)胞用神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。
　　 3.采用間接共培養(yǎng)方法，將SGCs與培養(yǎng)第3代BMSCs按1∶1比例進(jìn)行共培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞形態(tài)。取第7天的BMSCs用NSE一抗進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，觀察是否有染色陽(yáng)性的神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　 結(jié)果：
　　 1.酶消化法

3、SGCs培養(yǎng)24小時(shí)后，大部分細(xì)胞貼壁，并出現(xiàn)較短的軸突，48-72小時(shí)軸突逐漸變長(zhǎng)，細(xì)胞胞體呈橢圓形或圓形，突起細(xì)長(zhǎng)，常交織成網(wǎng)狀，培養(yǎng)6至14天時(shí)，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，部分細(xì)胞凋亡。組織塊法接種24小時(shí)后，組織塊貼壁。細(xì)胞形態(tài)與酶消化法相似，但生存時(shí)間比它更長(zhǎng)。
　　 2.原代培養(yǎng)的BMSCs24h-48h后貼壁細(xì)胞，呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞呈短梭型、多角型等。第6d起細(xì)胞迅速增殖，培養(yǎng)11天時(shí)，細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底的80-90％左右傳代，

4、第二代細(xì)胞增殖速度較第一代細(xì)胞明顯增快。培養(yǎng)至第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)為均一的“紡錘形”，呈明顯的漩渦樣生長(zhǎng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)，造血干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD34表達(dá)呈陰性，間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志抗原CD44表達(dá)陽(yáng)性，免疫細(xì)胞化學(xué)染色呈陽(yáng)性，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)分析符合大鼠BMSCs的特征。
　　 3.共培養(yǎng)組中BMSCs第5天開始突起增加，有的呈星狀。共培養(yǎng)組中SGCs與對(duì)照組中SGCs相比，前者SGCs維持時(shí)間相對(duì)更長(zhǎng)，第6天神經(jīng)細(xì)胞數(shù)

5、量減少，部分細(xì)胞軸突縮短，而后者第4天數(shù)量就開始出現(xiàn)減少，15天時(shí)，共培養(yǎng)組中SGCs數(shù)量已明顯減少，而對(duì)照組中SGCs接近凋亡。取第7天的BMSCs進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色，可見有細(xì)胞著色，染色時(shí)間為5分鐘，陽(yáng)性率約為15％，第一對(duì)照組BMSCs幾乎呈陰性。
　　 結(jié)論：
　　 1.體外成功培養(yǎng)了SD大鼠SGCs，組織塊法培養(yǎng)比酶消化法培養(yǎng)SGCs生存時(shí)間更長(zhǎng)。
　　 2.單純應(yīng)用貼壁培養(yǎng)法獲得SD大鼠BMSCs簡(jiǎn)