SD大鼠螺旋神經節(jié)細胞與骨髓間充質干細胞共培養(yǎng)觀察.pdf

1、目的：SD大鼠原代螺旋神經節(jié)細胞(Spiral ganglion cells，SGC)與骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells BMSCs)間接共培養(yǎng)，觀察BMSCs是否誘導分化為神經細胞，并觀察其對SGCs生長影響，為治療感音神經性耳聾治療尋求新的治療方法。
　　 方法：
　　 1.BMSCs的原代及傳代培養(yǎng):SD大鼠全骨髓直接貼壁法培養(yǎng)BMSCs并進行傳代培養(yǎng)，取第3代

2、細胞進行流式細胞儀檢測及免疫細胞化學染色。
　　 2.SGCs的原代培養(yǎng)，取新生SD大鼠進行離體SGCs離體培養(yǎng)，取第3天細胞用神經元特異性烯醇化酶(NSE)進行免疫細胞化學染色。
　　 3.采用間接共培養(yǎng)方法，將SGCs與培養(yǎng)第3代BMSCs按1∶1比例進行共培養(yǎng)，每天觀察細胞形態(tài)。取第7天的BMSCs用NSE一抗進行免疫細胞化學染色，觀察是否有染色陽性的神經元樣細胞。
　　 結果：
　　 1.酶消化法

3、SGCs培養(yǎng)24小時后，大部分細胞貼壁，并出現(xiàn)較短的軸突，48-72小時軸突逐漸變長，細胞胞體呈橢圓形或圓形，突起細長，常交織成網狀，培養(yǎng)6至14天時，細胞數(shù)量明顯減少，部分細胞凋亡。組織塊法接種24小時后，組織塊貼壁。細胞形態(tài)與酶消化法相似，但生存時間比它更長。
　　 2.原代培養(yǎng)的BMSCs24h-48h后貼壁細胞，呈集落樣生長，細胞呈短梭型、多角型等。第6d起細胞迅速增殖，培養(yǎng)11天時，細胞長滿瓶底的80-90％左右傳代，

4、第二代細胞增殖速度較第一代細胞明顯增快。培養(yǎng)至第3代時，細胞形態(tài)為均一的“紡錘形”，呈明顯的漩渦樣生長。流式細胞儀檢測，造血干細胞和內皮細胞表面標志抗原CD34表達呈陰性，間充質干細胞表面標志抗原CD44表達陽性，免疫細胞化學染色呈陽性，結合細胞形態(tài)分析符合大鼠BMSCs的特征。
　　 3.共培養(yǎng)組中BMSCs第5天開始突起增加，有的呈星狀。共培養(yǎng)組中SGCs與對照組中SGCs相比，前者SGCs維持時間相對更長，第6天神經細胞數(shù)

5、量減少，部分細胞軸突縮短，而后者第4天數(shù)量就開始出現(xiàn)減少，15天時，共培養(yǎng)組中SGCs數(shù)量已明顯減少，而對照組中SGCs接近凋亡。取第7天的BMSCs進行免疫細胞化學染色，可見有細胞著色，染色時間為5分鐘，陽性率約為15％，第一對照組BMSCs幾乎呈陰性。
　　 結論：
　　 1.體外成功培養(yǎng)了SD大鼠SGCs，組織塊法培養(yǎng)比酶消化法培養(yǎng)SGCs生存時間更長。
　　 2.單純應用貼壁培養(yǎng)法獲得SD大鼠BMSCs簡