球形芽胞桿菌X050晶體蛋白的特性及其抗腫瘤活性研究.pdf

1、從長沙岳麓山采集的土樣中篩選出一株芽胞桿菌，經(jīng)抗腫瘤活性檢測，結合形態(tài)特征觀察、生理生化實驗及16S rRNA基因Blast同源序列比對分析，確定了一株含伴胞晶體且高毒力球形芽胞桿菌新菌株，命名為Lysinibacillus sphaericus X050，簡稱BsX050（保藏號CCTCC NO:M2014160）。
　　測定BsX050菌株的發(fā)酵生長曲線，收集不同生長階段的上清液，進行抗腫瘤實驗，發(fā)現(xiàn)BsX050菌株進入穩(wěn)定期

2、后，發(fā)酵上清液對B16細胞和HeLa細胞具有明顯的毒性。用60％的硫酸銨沉淀，粗提蛋白進行抗腫瘤譜的測定，結果表明BsX050菌株發(fā)酵上清液對B16、4T1、Hep-3B、HT29、MCF-7和HeLa具有廣譜的抗腫瘤活性。進一步用GE-蛋白純化儀(AKTA)和安捷倫超高效液相色譜（UHPLC）對發(fā)酵液中抗腫瘤活性物的分離純化條件進行了初步優(yōu)化。
　　提取BsX050菌株的伴胞晶體進行電鏡觀察，結果發(fā)現(xiàn)伴胞晶體呈圓形或橢圓形，結構

3、松散，致密性不好;SDS-PAGE檢測及膠內酶解質譜鑒定，其為Surface protein SlpC OS，分子量為125kDa。Zn2+對伴孢晶體產(chǎn)量影響的分析表明Zn2+的濃度為10-6mol/L時伴胞晶體產(chǎn)量提高，Zn2+的濃度為10-3mol/L時伴胞晶體的產(chǎn)生基本被抑制。對伴胞晶體進行溶解性和穩(wěn)定性分析，結果發(fā)現(xiàn)該伴胞晶體在pH為12.5，且不含β-巰基乙醇的50mM Na2CO3溶液中溶解出較多的晶體蛋白，胰蛋白酶與晶體蛋

4、白的體積比為1/10，在37℃放置3h后，晶體蛋白全部被酶解成晶體毒素蛋白。晶體毒素蛋白作用4T1細胞，Hep-3B細胞和HUVEC細胞24h后，倒置顯微鏡和掃描電鏡下觀察到4T1和Hep-3B形態(tài)發(fā)生明顯變化，而HUVEC的形態(tài)無明顯變化，采用MTT法測定晶體毒素蛋白對4T1、Hep-3B和HUVEC的細胞毒力，發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白對4T1和Hep-3B細胞毒力呈時間與濃度的依賴性，而對HUVEC細胞增殖無明顯影響。激光共聚焦顯微鏡觀察到

5、晶體毒素蛋白能損傷4T1和Hep-3B的亞顯微結構，細胞核皺縮變小，微管蛋白減少并向細胞核靠攏使細胞變圓，線粒體熒光強度減弱，而對HUVEC的亞顯微結構無明顯的損傷，晶體毒素蛋白處理4T1和Hep-3B細胞后，提取其DNA，凝膠電泳檢測到DNA“梯狀”條帶，流式細胞術發(fā)現(xiàn)晶體毒素蛋白誘導4T1細胞發(fā)生凋亡，使細胞被阻滯在G0/G1期，westernblotting發(fā)現(xiàn)Bax蛋白及PARP剪切蛋白表達上調，Bcl-2蛋白表達下調。上述結果