兩相體系中分枝桿菌降解植物甾醇側(cè)鏈制備雄甾-4-烯-3，17-二酮過程研究.pdf

1、雄甾-4-烯-3，17-二酮(AD)是合成多種甾體藥物的重要前體物質(zhì)，可通過分枝桿菌選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈制備得到，但該過程中存在底物溶解度低及產(chǎn)物AD對微生物細(xì)胞的毒害性等問題。兩相體系作為底物和產(chǎn)物的“儲物池”，可有效解決植物甾醇降解過程中存在的問題。本論文以分枝桿菌Mycobacterium sp.MB3683作為催化劑，構(gòu)建兩相體系，開展了微生物降解植物甾醇側(cè)鏈生產(chǎn)AD的研究，以期提高底物的溶解度，縮短反應(yīng)時間，實現(xiàn)細(xì)胞的重復(fù)利

2、用。
　　首先構(gòu)建了雙水相體系，測定了分枝桿菌細(xì)胞和產(chǎn)物AD在聚合物/聚合物、聚合物/鹽雙水相體系中的分配系數(shù)，考察了不同分子量聚乙二醇對分枝桿菌的毒性以及添加表面活性劑、溶氧量等對AD生產(chǎn)的影響，研究了高投料濃度下的轉(zhuǎn)化情況，并進行了初步放大實驗。結(jié)果表明，在組成為聚乙二醇6000(7％(wt))/葡聚糖70000(8％(wt))雙水相體系中，AD主要分布在富含聚乙二醇的上相，而細(xì)胞則主要分布在富含葡聚糖的下相。規(guī)模為200 g

3、的雙水相體系，在吐溫40添加量1％(V/V)、轉(zhuǎn)速240r min-1的優(yōu)化條件下，將植物甾醇投料濃度提高到10gL-1，發(fā)酵96h后AD的濃度達到1.1g L-1。雙水相體系具有較好的生物相容性，可應(yīng)用于分枝桿菌降解植物甾醇萃取發(fā)酵生產(chǎn)AD，部分緩解了轉(zhuǎn)化過程中存在的產(chǎn)物抑制作用，為雙水相體系的工業(yè)應(yīng)用積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　其次選取9種植物油構(gòu)建了植物油/水兩相體系，用于分枝桿菌靜息細(xì)胞催化植物甾醇側(cè)鏈降解過程研究。選取大豆油/

4、水兩相體系為研究對象，對靜息細(xì)胞制備時間、細(xì)胞催化時間進行了優(yōu)化，確定養(yǎng)菌時間為72h并將轉(zhuǎn)化時間縮短至24h。進一步對相比、轉(zhuǎn)速、細(xì)胞濃度和投料濃度等重要參數(shù)進行了探索。結(jié)果表明，在相比2∶8（油∶水，V∶V）、轉(zhuǎn)速200r min-1、靜息細(xì)胞濃度200g L-1、投料濃度10g L-1時轉(zhuǎn)化效果最好，AD濃度高達2.7g L-1，時空產(chǎn)率達0.1g L-1h-1。靜息細(xì)胞催化過程能夠通過高密度細(xì)胞實現(xiàn)，大大縮短了反應(yīng)時間，充分展現(xiàn)

5、了其在植物油/水兩相體系中降解植物甾醇側(cè)鏈的可行性和優(yōu)勢。
　　最后選取大豆油/水兩相體系用于分枝桿菌固定化細(xì)胞催化植物甾醇側(cè)鏈降解生產(chǎn)AD的研究。分別利用海藻酸鈣包埋、硅藻土和絲瓜絡(luò)吸附的方法固定化分枝桿菌，與游離細(xì)胞對比發(fā)現(xiàn)，絲瓜絡(luò)吸附的分枝桿菌用做催化劑時效果最佳，并采用掃描電鏡和傅里葉變換紅外光譜分析了絲瓜絡(luò)與分枝桿菌細(xì)胞間的相互作用。最后以絲瓜絡(luò)為固定化載體，研究了載體的添加量、接種量等操作條件對 AD生產(chǎn)的影響。在30