分枝桿菌BD696-6固定化發(fā)酵產(chǎn)雄烯二酮的研究.pdf

1、雄烯二酮(AD)是合成甾體激素類藥物不可替代的中間體，隨著薯芋皂素資源日漸枯竭，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)AD是目前研究的熱點(diǎn)課題之一。菌株Mycobacterium sp. BD696-6(簡稱BD696-6)可轉(zhuǎn)化植物甾醇為雄烯二酮，但其發(fā)酵過程中存在菌體濃度低、發(fā)酵周期長、轉(zhuǎn)化率低等缺點(diǎn)。許多研究表明，固定化技術(shù)能有效保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，促進(jìn)目標(biāo)產(chǎn)物的積累。本論文采用海藻酸鈉包埋法和硅藻土吸附法固定菌體細(xì)胞，探索固定化條件及發(fā)酵條件對分枝

2、桿菌BD696-6發(fā)酵產(chǎn)AD的影響，主要研究結(jié)果如下。 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到菌株BD696-6的最適固定化條件，海藻酸鈉濃度3g/100mL、CaCl2濃度1g/100mL、菌體包埋量15mL/50mL凝膠，靜置固化時(shí)間1h；該條件下進(jìn)行菌株BD696-6固定化細(xì)胞與游離細(xì)胞對比試驗(yàn)，發(fā)酵周期由168h縮短為144h，AD轉(zhuǎn)化率提高了17.93％。對固定化菌株BD696-6發(fā)酵條件進(jìn)行的研究結(jié)果表明，將20mL凝

3、膠菌體混合液裝入50mL轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基/250mL搖瓶、發(fā)酵溫度32℃、初始pH8.5、搖床轉(zhuǎn)速230r/min、甾醇添加量5 g/L時(shí)，AD轉(zhuǎn)化率最高達(dá)80.83％，且固定化細(xì)胞具有較好的貯存穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。掃描電鏡顯示以海藻酸鈉為包埋載體時(shí)，營養(yǎng)物質(zhì)可自由傳輸。 以硅藻土作為菌株BD696-6吸附載體，經(jīng)吸附固定后，通過正交試驗(yàn)獲得硅藻土吸附固定化細(xì)胞的條件為載體添加量7g/L、最佳接種量18％、甾醇添加量3g/L、發(fā)酵時(shí)

4、間168h，AD轉(zhuǎn)化率達(dá)到81.47％，比游離細(xì)胞發(fā)酵AD轉(zhuǎn)化率提高了19.82％。對硅藻土吸附固定細(xì)胞發(fā)酵條件的研究表明，較適的搖床轉(zhuǎn)速200r/min、發(fā)酵溫度32℃、初始pH8.7、甘氨酸添加量4g/L發(fā)酵培養(yǎng)基，表面活性劑吐溫-80對發(fā)酵影響不大，金屬離子Fe2+、Zn2+、Mg2+對AD轉(zhuǎn)化率有明顯的促進(jìn)作用，其中加入FeSO4·7H2O0.1g/L，AD轉(zhuǎn)化率最高，其值為85.64％。 5L發(fā)酵罐中進(jìn)行放大試驗(yàn)的結(jié)果