蜱傳腦炎病毒診斷抗原的篩選及LI PS檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)化.pdf

1、蜱傳腦炎病毒（Tick-borne encephalitis virus）是黃病毒科黃病毒屬的一種烈性病毒，主要通過(guò)蜱蟲叮咬傳播，可引起嚴(yán)重的臨床癥狀，威脅人類的健康和社會(huì)安定。蜱傳腦炎病毒主要有歐洲型、西伯利亞型和遠(yuǎn)東型三種亞型，我國(guó)主要為遠(yuǎn)東型TBEV，致死率約為20％，因此蜱傳腦炎病毒感染的臨床診斷對(duì)疾病的控制和治療有重要意義。TBEV病毒的基因組是由單股正鏈RNA構(gòu)成的，共編碼三種結(jié)構(gòu)蛋白和七種非結(jié)構(gòu)蛋白，其中的包膜糖蛋白( E

2、蛋白)由496個(gè)氨基酸構(gòu)成，包含了天然病毒90%的抗原中和表位，是TBEV感染的檢測(cè)抗原的首選。目前對(duì) TBEV感染血清學(xué)檢測(cè)的抗原，既有通過(guò)病毒培養(yǎng)獲得的全病毒抗原，也有通過(guò)體外表達(dá)獲得的胞膜糖蛋白片段。
　　本研究表達(dá)了含有較多抗原表位的完整E蛋白胞外區(qū)，評(píng)價(jià)了其在TBEV感染血清檢測(cè)中的效果，并優(yōu)化了TBEV感染血清檢測(cè)的一種新型的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)-熒光素酶免疫共沉淀（Luciferase immunoprecipitatio

3、n system,LIPS）。熒光素酶免疫共沉淀是將熒光素酶基因與抗原基因共表達(dá)，并由真核表達(dá)系統(tǒng)制備檢測(cè)抗原，通過(guò)檢測(cè)抗原-抗體-瓊脂糖凝珠混合物中的熒光素酶活性來(lái)判斷待檢樣品中的抗體含量。該方法具有檢測(cè)靈敏性高、操作簡(jiǎn)單快捷等優(yōu)點(diǎn)。
　　本研究的主要內(nèi)容如下：
　　一、TBEV包膜糖蛋白胞外區(qū)密碼子的優(yōu)化、表達(dá)及檢測(cè)效果評(píng)價(jià)
　　首先本研究對(duì)TBEV包膜糖蛋白（ E蛋白）的抗原結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了分析，選用TBEV-MDJ

4、01株的E蛋白胞外區(qū)（EC）作為TBEV感染血清的檢測(cè)抗原，并通過(guò)LIPS方法評(píng)價(jià)其檢測(cè)效果。通過(guò)對(duì) EC原始基因序列進(jìn)行真核密碼子優(yōu)化，由基因合成優(yōu)化的胞外區(qū)基因序列（OPT-EC）。將抗原基因與Rluc（Re nilla luc iferase）基因進(jìn)行融合構(gòu)建重組質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞獲得重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC。比較優(yōu)化基因和原始基因的表達(dá)量的差異，并將重組抗原用于臨床感染血清樣本

5、的免疫共沉淀檢測(cè)（LIPS），以評(píng)價(jià)抗原的靈敏性和特異性。
　　對(duì)獲得的重組抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC的熒光活性檢測(cè)結(jié)果顯示，真核密碼子優(yōu)化后的胞外區(qū)基因（Rluc-OPT-EC）的表達(dá)量約是原始基因序列Rluc-EC的12倍。將重組抗原Rluc-OPT-EC用于TBEV感染血清的LIPS檢測(cè)，OPT-EC的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到86%以上，其對(duì)乙型腦炎病毒（JEV）感染血清、黃熱病毒（YFV）感染血清、流感病毒（AI

6、V）感染血清和正常人血清的檢測(cè)特異度高于90%，但是在西尼羅病毒（WNV）感染血清和登革病毒（DENV）感染血清的檢測(cè)中存在交叉反應(yīng)。
　　實(shí)驗(yàn)證明真核密碼子優(yōu)化能夠有效地提高外源蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)量，且優(yōu)化后的E蛋白胞外區(qū)蛋白作為 TBEV感染的檢測(cè)抗原，能夠有效地區(qū)分JEV、YFV感染，但是不能區(qū)分于WVN和DV感染。
　　二、新型LIPS檢測(cè)技術(shù)的建立和優(yōu)化
　　1.構(gòu)建表達(dá)TBEV檢測(cè)抗原的穩(wěn)定細(xì)胞系<

7、br>　　LIPS檢測(cè)中真核表達(dá)抗原是通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法制備的，存在實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)、檢測(cè)抗原不穩(wěn)定且需重復(fù)制備等問(wèn)題，為了進(jìn)一步優(yōu)化抗原的制備方法，本研究采用慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，通過(guò)將Rluc-VE3和Rluc-OPT-EC融合基因插入慢病毒載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞獲得慢病毒包裝顆粒。該慢病毒包裝顆粒能夠感染真核細(xì)胞，通過(guò)感染COS7細(xì)胞，慢病毒將自身基因組整合到細(xì)胞基因組中，經(jīng)過(guò)RFP和嘌呤素酶篩選，

8、由單克隆細(xì)胞分裂獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株，并對(duì)細(xì)胞株的外源蛋白表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，分別對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行海腎熒光素酶活性檢測(cè)和TBEV感染血清檢測(cè)。
　　經(jīng)單克隆篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白的細(xì)胞株，細(xì)胞株具備表達(dá)紅色熒光蛋白和嘌呤素酶抗性，初步說(shuō)明慢病毒基因組已整合到細(xì)胞基因組中，進(jìn)一步通過(guò)檢測(cè)海腎熒光素酶和抗原的表達(dá)對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，穩(wěn)定細(xì)胞株的細(xì)胞裂解液中，能夠檢測(cè)到海腎熒光素酶活性，Rluc-VE3的熒光強(qiáng)度為

9、5.14×106LU，Rluc-OPT-EC的熒光強(qiáng)度為4.29×105LU，Rluc-VE3的表達(dá)量高于Rluc-ORT-EC，分析原因可能是由于Rluc-ORT-EC的分子量較大，從而影響其表達(dá)量。對(duì)穩(wěn)定表達(dá)的重組抗原Rluc-VE3進(jìn)行LIPS檢測(cè)，以判斷其是否表達(dá)有VE3抗原。結(jié)果表明重組抗原Rluc-VE3在19份TBEV感染血清中，檢測(cè)出13份陽(yáng)性，檢測(cè)靈敏度為76.47%（**P＜0.01），而在實(shí)驗(yàn)室前期工作中，通過(guò)細(xì)胞

10、轉(zhuǎn)染制備的Rluc-VE3的TBEV陽(yáng)性檢出率79.2%，穩(wěn)定表達(dá)抗原的檢出率與該結(jié)果相近，說(shuō)明構(gòu)建的穩(wěn)定細(xì)胞系COS7-Rluc-VE3表達(dá)的重組抗原Rluc-VE3可用于TBEV感染血清的LIPS檢測(cè)。
　　本研究中構(gòu)建了能穩(wěn)定表達(dá)檢測(cè)抗原的細(xì)胞系，簡(jiǎn)化了抗原制備的方法，降低了實(shí)驗(yàn)成本、操作時(shí)間，能夠持續(xù)穩(wěn)定的為TBEV感染血清的檢測(cè)提供診斷抗原。
　　2.檢測(cè)標(biāo)記物的優(yōu)化-以更為穩(wěn)定的Nanoluc代替Rluc

11、　　在實(shí)驗(yàn)操作中，研究發(fā)現(xiàn)Renilla luciferase的熱穩(wěn)定性不好，在37℃環(huán)境中，其熒光素酶活性的半衰期只有10min，在以往的實(shí)驗(yàn)中采用的均是室溫孵育，而抗原抗體的最佳結(jié)合條件是37℃，在該溫度條件下可縮短抗原抗體的結(jié)合時(shí)間，從而使檢測(cè)更加快速。為了改善Renilla luciferase對(duì)環(huán)境溫度的限制，選擇了新型的基因工程改造酶Nano luciferase作為 LIPS檢測(cè)中的標(biāo)記蛋白，Nano luciferase

12、具備分子量小、熒光信號(hào)強(qiáng)且?guī)в蠳-末端分泌信號(hào)等優(yōu)勢(shì)，可使真核表達(dá)抗原的制備從原來(lái)收集細(xì)胞裂解液，改善為收集細(xì)胞上清液，減少抗原中的雜蛋白成分，提高檢測(cè)靈敏性。將Nanoluc基因與抗原基因共表達(dá)，制備重組抗原Nanoluc-VE3，并對(duì)該抗原的熒光素酶活性、熱穩(wěn)定性和作為檢測(cè)抗原的檢測(cè)效果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，成功制備了Nanoluc-VE3重組抗原，從Nanoluc-VE3和Rluc-VE3的熱穩(wěn)定性結(jié)果看出，Nano

13、luc-VE3在37℃和室溫條件下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)其熒光強(qiáng)度并沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明Nanoluc在37℃和室溫的穩(wěn)定性均良好。對(duì)Nanoluc-VE3和Rluc-VE3熒光素酶活性的檢測(cè)中，Nanoluc-VE3的熒光強(qiáng)度為7.79×109LU，而Rluc-VE3的熒光強(qiáng)度為6.71×106LU，Nanluc-VE3的熒光信號(hào)要明顯高于Rluc-VE3的熒光信號(hào)強(qiáng)度。
　　將Nanoluc-VE3作為檢測(cè)抗原用于TBEV感染血清的LI

14、PS檢測(cè)，對(duì)30份TBEV感染血清的檢測(cè)中共檢出28份陽(yáng)性，表明Nanoluc-VE3能夠作為檢測(cè)抗原應(yīng)用于TBEV感染血清的LIPS檢測(cè)，在此基礎(chǔ)上，重新構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)重組抗原Nanluc-VE3的穩(wěn)定細(xì)胞株，該細(xì)胞株能夠持續(xù)穩(wěn)定的向胞外分泌重組抗原Nanluc-VE3，并將其應(yīng)用于感染血清的檢測(cè)。穩(wěn)定表達(dá)的Nanluc-VE3對(duì)30份TBEV感染血清的檢測(cè)靈敏度為93.33%，該檢測(cè)結(jié)果高于Rluc-VE3對(duì)TBEV感染血清的檢

15、測(cè)靈敏度（76.47%），說(shuō)明 Nanoluc-VE3的檢測(cè)信號(hào)靈敏度更高，胞外表達(dá)的抗原雜蛋白少，檢測(cè)精準(zhǔn)度更高。對(duì)JEV和DV感染血清的檢測(cè)特異性為100%，說(shuō)明通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞系制備的重組抗原Nanoluc-VE3能夠用于LIPS檢測(cè)，因此本部分實(shí)驗(yàn)為L(zhǎng)IPS檢測(cè)提供新型的熒光蛋白標(biāo)簽。
　　本研究評(píng)價(jià)了E蛋白胞外區(qū)作為TBEV感染血清檢測(cè)抗原的檢測(cè)效果，為TBEV血清學(xué)檢測(cè)的抗原篩選提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。并優(yōu)化了用于TBEV血