自身免疫性肝炎淋巴細胞亞群異常及MSCs免疫調(diào)控機制的研究.pdf

1、目的：
　　 通過檢測自身免疫性肝炎（Autoimmunehepatitis，AIH）患者的外周血T淋巴細胞亞群、B淋巴細胞亞群和調(diào)節(jié)性T細胞表達，分析其與肝功能、免疫球蛋白和肝臟炎癥活動指數(shù)(Hepatitisactivityindex，HAI)的相關(guān)性，了解淋巴細胞亞群在AIH發(fā)病中的作用機制，為AIH的診治提供依據(jù)。對接受骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)移植治療的AIH模型小鼠肝組織內(nèi)

2、CD3+細胞、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)、程序性死亡分子1(Programmeddeath-1，PD-1)、程序性死亡配體-1(Programmeddeathligand-1，PD-L1)表達進行檢測，初步探討MSCs通過PD-1通路免疫調(diào)控治療AIH的機制。
　　 方法：
　　 1、選擇確診為AIH且未接受激素及免疫抑制劑治療的患者20例，為AIH組，以20例健康成年人為對照組。兩組分別進行肝功

3、能指標(biāo)（血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanineaminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartateaminotransferase,AST）、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)、γ-谷胺酰轉(zhuǎn)移酶（γ-glutamyltransferase，γ-GT））、血清總膽紅素(Totalbilirubin，TBIL)、直接膽紅素(Directbilirubin，DBIL);免疫球蛋白(免疫球蛋白G(immu

4、noglobulinG，IgG)、免疫球蛋白M(immunoglobulinM，IgM)、免疫球蛋白A（immunoglobulinA，IgA））的檢測;AIH組行肝穿刺活組織病理檢查，評價肝炎活動性指數(shù)HAI。應(yīng)用流式細胞術(shù)分別檢測兩組外周血T、B淋巴細胞亞群表面標(biāo)志的表達情況，并將淋巴細胞亞群比率與肝功能指標(biāo)、免疫球蛋白及HA1評分進行相關(guān)性分析。
　　 2、以AIH模型小鼠接受MSCs移植治療，分為MSCs治療組、PBS對

5、照治療組和正常對照組，三組分別于造模時、治療后1周、4周三個時間點取鼠肝組織。三組小鼠不同時間點肝組織樣本數(shù)均為10個。用免疫組化方法檢測各組小鼠各時間點肝組織內(nèi)CD3+、IFN-γ、PD-1和PD-L1的表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.AIH患者外周血淋巴細胞亞群異常改變與肝功能、免疫球蛋白和肝炎活動指數(shù)的關(guān)系
　　 1.1AIH組外周血CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD19+B、CD5+CD19

6、+B細胞百分比及CD5+CD19+B/CD19+B細胞比值分別為46.00±16.84％、34.26±11.60％、13.62±5.55％、8.45±6.09％、0.62±0.15，均明顯高于對照組的35.50±3.59％、25.21±2.89％、9.85±1.21％、2.84±0.92％、0.29±0.10，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。AIH組CD3+T細胞百分比、CD4+CD25+CD127dimT細胞百分比和CD3+CD4+

7、T/CD3+CD8+T細胞比值分別為64.23±13.24％、5.59±2.17％、1.30±0.25，而對照組為69.38±4.32％、6.09±1.36％、1.42±0.19，兩組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05）。
　　 1.2AIH組ALT、AST、ALP、γ-GT、TBIL、DBIL分別為197.00±183.915U/L、188.65±180.00U/L、189.30±38.10U/L、148.00±39.61U/

8、L、87.88±114.88μmol/L、59.97±83.91μmol/L;正常對照組分別為25.65±10.80U/L、22.40±8.75U/L、90.85±35.51U/L、31.60±16.29U/L、13.90±10.90μmol/L、5.59±4.16μmol/L兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。AIH組IgG、gM、IgA，分別為1824.95±753.54mg/dL、141.13±63.04mg/dL、284.10±176.0

9、3mg/dL，正常組為1182.70±325.12mg/dL、165.20±90.23mg/dL、229.00±119.16mg/dL，兩組IgG相比，有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）;而IgM，IgA，兩組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。AIH組HAI評分為7.60±4.51分。
　　 1.3AIH組CD3+CD4+T和CD3+CD8+T細胞百分比分別與血清ALT、AST、肝臟HAI評分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.896、0.

10、879、0.763（P＜0.01）和r=0.877、0.843、0.642（P＜0.01），與ALP、γ-GT、TBIL、DBIL無明顯相關(guān)性(P＞0.05);AIH組患者的B細胞亞群CD5+CD19+B細胞百分比分別與肝功能指標(biāo)ALT、AST呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.486，0.450（P＜0.05），與HAI評分呈正相關(guān)(r=0.544，P＜0.05)，與ALP、GGT、TBIL、DBIL無相關(guān)性（P＞0.05）;CD5+CD1

11、9+B細胞比率與IgG呈顯著正相關(guān)（r=0.832，P＜0.01），與IgM、IgA無相關(guān)性（P＞0.05）。
　　 2MSCs治療后肝組織中CD3、IFN-γ、PD-1和PD-L1表達。
　　 2.1MSCs治療組在造模時、治療后1周、4周三個時間點CD3+細胞的百分比分別為36.00±5.07％、27.94±2.33％、21.58±4.60％，組內(nèi)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療后1周、4周與造模時相比

12、，CD3+細胞百分比分別下降了22％和40％。且在治療后1周與4周時，MSCs治療組與PBS治療組組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.784，P＜0.05vst=4.409，P＜0.05）。
　　 2.2MSCs治療組三個時間點IFN-γ陽性細胞百分比分別為30.06±5.19％、26.52±3.88％、20.86±3.35％，組內(nèi)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），在治療后1周、4周兩個時間點，與造模時相比，IFN-γ陽

13、性細胞百分比分別下降了12％和31％。在治療后1周與4周，MSCs治療組與PBS治療組組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.182，P＜0.05vst=4.679，P＜0.05）。
　　 2.3MSCs治療組三個時間點PD-1陽性細胞表達率分別為17.92±4.29％、13.24±2.71％、10.98±2.47％，組內(nèi)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在治療后1周、4周兩個時間點，與造模時相比，PD-1陽性細胞百分比分別

14、下降了26％和39％。在治療后1周與4周，MSCs治療組與PBS治療組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.862,P＜0.05vst=4.289，P＜0.05）。
　　 2.4MSCs治療組三個時間點PD-L1陽性細胞百分比分別為3.12±1.19％、8.94±3.39％、12.38±4.20％，組內(nèi)相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在治療后1周與4周，MSCs干預(yù)后，PD-L1陽性細胞表達，分別比造模時上升了1.9倍和3倍

15、。同時，MSCs治療組與PBS治療組組間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-4.87,P＜0.05vst=-6.15,P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、AIH患者外周血CD4+T細胞、CD8+T細胞、CD19+B細胞、CD5+CD19+B細胞百分比以及CD5+CD19+B/CD19+B細胞比值，較正常人明顯升高;并且與AIH患者肝功能指標(biāo)ALT、AST，IgG及HAI呈正相關(guān)關(guān)系，提示T、B淋巴細胞亞群的異常表達增高與