銅綠假單胞菌藻多糖生物合成所需蛋白Alg44結構與功能研究.pdf

1、藻多糖(Algniate)是條件致病菌銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)產生的一種重要的毒力因子，是銅綠假單胞菌分泌的三種主要多糖之一。這種多糖主要是從患有囊胞性纖維癥（銅綠假單胞菌的感染是引起該病發(fā)病和死亡的主要原因）的患者肺部分離得到的銅綠假單胞菌所產生，此菌是一類粘液型的銅綠假單胞菌，藻多糖是此菌致病和在患者體內生存的主要原因之一。同時，銅綠假單胞菌的耐藥性和Algniate有很大關系。研究表明，這種多糖

2、能夠清除中性粒細胞和激活的巨噬細胞釋放的專門殺死病原體的自由基。因為這種多糖與銅綠假單胞菌的致病性息息相關，因此對這種多糖的合成的研究是比較透徹的。目前的研究表明，在銅綠假單胞菌體內合成Algniate的13種蛋白質通過形成一個橫跨細胞內膜、周質空間、細胞外膜的復合體來行使功能。敲除參與Algniate合成的膜蛋白糖基轉移酶Alg8和c-di-gmp結合膜蛋白Alg44導致Algniate無法分泌，這說明Alg8和Alg44是這種多糖聚

3、合所必須的。
　　Alg44在合成藻多糖的過程中有重要作用，但是關于具體的調控機制卻不是很清楚。所以我們選擇了銅綠假單胞菌中Alg44作為我們主要的研究對象，希望從蛋白結構方面對該蛋白的作用機制做出闡釋。Alg44是一個單次跨膜的細胞質膜蛋白，N端位于細胞質，是一個PilZ結構域，是一個典型的c-di-gmp結合結構域，研究表明，結合了c-di-gmp的N端結構域對Algniate合成是必需的，C端結構域位于周質空間，可能與形成大

4、的蛋白質復合物有關。
　　我們嘗試通過分子克隆和膜蛋白純化方法對Alg44全長蛋白進行純化，但是遺憾的是沒有成功，我們又嘗試著進行了結構域片段的截取，截取的片段有N端PilZ結構域的多個片段，以及C端結構域的多個片段。我們獲得了可溶的PilZ結構域蛋白(16-122)，并且通過普篩獲得了不帶有組氨酸標簽的PilZ結構域和c-di-gmp的復合物的晶體，進行優(yōu)化后獲得性狀良好的晶體，在上海同步輻射光源（SSRF）收集并處理了晶體數(shù)據(jù)

5、，利用coot，ccp4,phenix，CNS等軟件解析了Alg44 PilZ結構域的結構。
　　經典的PilZ結構域通常是一個單體結合兩個c-di-gmp，但是有趣的是，從我們的結構上卻看到一個單體結合了三個c-di-gmp，其中有一個與蛋白質單體沒有任何接觸，我們猜測可能是由于c-di-gmp量過多引起的，于是我們就將c-di-gmp和蛋白的比例從原來的5∶1變?yōu)榱?∶1,解析出的蛋白質結構中c-di-gmp和蛋白質單體的結合

6、變成了經典的2∶1,兩個c-di-gmp和蛋白質平行排列。我們觀察到了c-di-gmp在蛋白質結構中的多態(tài)性，我們認為這并不是偶然出現(xiàn)的，c-di-gmp可以以多種方式幫助蛋白質有規(guī)律的折疊，這是以前都沒有報道過的。
　　PilZ結構域的晶體中，一個不對稱單元中有兩個單體，在晶體結構中是個二體，通過分析柱分析發(fā)現(xiàn)，在溶液中，該蛋白質也是二體的狀態(tài)。為了弄清該二體的形成是否是因為c-di-gmp的原因，我們根據(jù)晶體結構，突變了c-d