高效分離人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSCs)方法的研究.pdf

1、背景：
　　 人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞( human umbilical cord mesenchymal stem cells，HUCMSC)因其來源廣泛、無創(chuàng)傷、無倫理爭(zhēng)議，含量豐富而成為間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cells，MSC)治療的優(yōu)勢(shì)來源，可在細(xì)胞治療、組織工程等領(lǐng)域發(fā)揮極大的醫(yī)學(xué)價(jià)值。目前用來分離提取HUCMSC的方法主要有單酶(膠原酶、I膠原酶或IV型膠原酶)、雙酶(膠原酶與胰酶)以及三

2、酶(膠原酶、透明質(zhì)酸酶與胰酶)。但是這些傳統(tǒng)方法消化過程所需時(shí)間長(zhǎng)，所獲取的HUCMSC與臍帶組織中所含HUCMSC的理論值相差甚遠(yuǎn)，造成時(shí)間與臍帶組織的極大浪費(fèi)，阻礙了MSCs的規(guī)模化制備培養(yǎng)。因此，對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)HUCMSC的高效獲取，將會(huì)大大促進(jìn)HUCMSC廣泛應(yīng)用于臨床治療、組織工程、科學(xué)研究的進(jìn)程。
　　 目的：
　　 針對(duì)臍帶的結(jié)構(gòu)與組成成分，組合五種消化酶，提高對(duì)臍帶組織的消化程度，實(shí)現(xiàn)HUCMS

3、C分離提取方法的優(yōu)化，探尋并建立一套簡(jiǎn)單、高效、細(xì)胞獲取量大的HUCMSC分離方法。
　　 方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分為四組，以傳統(tǒng)酶法(胰酶與Ⅱ型膠原酶)為對(duì)照組，在此基礎(chǔ)上，針對(duì)臍帶結(jié)構(gòu)分別逐一加入IV型膠原酶、透明質(zhì)酸酶、DNase來對(duì)臍帶組織進(jìn)行消化，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)不同作用時(shí)間組，比較不同分離方法、不同作用時(shí)間所獲得細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞活性、原代貼壁細(xì)胞出現(xiàn)時(shí)間、融合時(shí)間及所獲得HUCMSC的在第3代細(xì)胞在增殖能力、表面標(biāo)記與多

4、向分化能力方面的差別。
　　 結(jié)果：
　　 各實(shí)驗(yàn)組間比較，在同一作用時(shí)間，隨著酶的種類的增加，細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活性表現(xiàn)出升高趨勢(shì)，差異顯著。同一實(shí)驗(yàn)組內(nèi)比較，隨著作用時(shí)間的增加細(xì)胞產(chǎn)量提高，在4～6h達(dá)到平臺(tái)，隨后細(xì)胞產(chǎn)量下降，差異意義顯著;細(xì)胞活性在4h達(dá)到最大，隨后呈下降趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其中Ⅱ型膠原酶、IV型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和DNAase五酶聯(lián)合作用于臍帶組織,4h細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)到最高12.47±0

5、.16×106/cm( P＜0.01);活性為75.00±5.07％(P＜0.01);收獲的混合細(xì)胞中CD105陽性率為41.1％; CD29陽性率為83.1％，均高于對(duì)照組;3.25±0.46d細(xì)胞貼壁((P＜0.01);6.25±0.46d細(xì)胞團(tuán)融合((P＜0.01);伴隨細(xì)胞的傳代，形態(tài)逐漸均一，第三代細(xì)胞形態(tài)基本達(dá)到統(tǒng)一，呈梭形漩渦狀生長(zhǎng);流式細(xì)胞儀鑒定，細(xì)胞高表達(dá)MSCs的特異性標(biāo)記CD44，CD105，CD29，而低表達(dá)CD

6、34;其中四酶實(shí)驗(yàn)組P3HUCMSCs的CD105陽性率為85.3％; CD29陽性率為97.6％; CD44陽性率為95.8％;陽性率均高于對(duì)照組，CD34％陽性率為2.6％，低于對(duì)照組。向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)4周后，油紅O染色鑒定分化結(jié)果，可見細(xì)胞內(nèi)大量脂滴;向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)后，茜素紅染色鑒定，肉眼可見陽性鈣沉積。因此，五酶聯(lián)合作用4h，在保證細(xì)胞高活性的前提下提高了細(xì)胞產(chǎn)量，縮短了原代細(xì)胞貼壁及融合時(shí)間縮短;培養(yǎng)獲得的HUCMSC在增殖能力

7、、表面標(biāo)記及多向分化能力方面與傳統(tǒng)方法相比無明顯差別，為高效分離提取HUCMSC最優(yōu)方案。
　　 結(jié)論：
　　 該實(shí)驗(yàn)證明了Ⅱ型膠原酶、Ⅳ型膠原酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶和DNAase五酶聯(lián)合消化臍帶組織作用4h的方法縮短了分離細(xì)胞用時(shí)并顯著提高了細(xì)胞產(chǎn)量、細(xì)胞活力以及細(xì)胞增殖能力，同時(shí)縮短原代細(xì)胞貼壁時(shí)間、融合時(shí)間。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫學(xué)表型顯示，該方法提取得到的原代細(xì)胞中MSCs比例，第三代MSCs細(xì)胞純度較傳統(tǒng)方法