光酶誘導(dǎo)桑葉中Diels--Alderase的分離鑒定及克隆表達(dá)研究.pdf

1、桑科植物在全世界范圍內(nèi)共有37個(gè)屬1100個(gè)物種，其中人們熟知的有桑樹(shù)，面包樹(shù)，見(jiàn)血封喉等。桑葉是桑屬植物桑（Morus alba L.）的葉片，是家蠶的主要食物來(lái)源。除此之外，桑的葉、果實(shí)和根皮都是常用中藥，在降血糖、滋補(bǔ)、治療外感風(fēng)熱、咳嗽咳喘方面療效顯著。研究組前期研究發(fā)現(xiàn)光酶誘導(dǎo)后桑葉中的moracin C，moracin N，morachalcone，guangsangon E和chalcomoracin含量顯著增加:其中ch

2、alcomoracin桑樹(shù)特有的一類Diels-Alder型加合物，在桑樹(shù)根皮中微量存在，偶爾在桑葉中分離得到，具有顯著的抗氧化、抗病毒、抑菌、抗腫瘤和降血糖生物活性。Chalcomoracin結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有三個(gè)手性中心，化學(xué)合成得率很低，雖然光酶誘導(dǎo)后的桑葉中chalcomoracin含量顯著提高，但桑葉所含化合物成分復(fù)雜，葉綠素干擾嚴(yán)重，提取分離成本較高。Diels-Alderase是存在于桑葉中，以moracin C和moracha

3、lcone為底物催化合成chalcomoracin的重要酶，本論文以Diels-Alderase的比活力和SDS-PAGE蛋白條帶為純化標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)光酶誘導(dǎo)桑葉中chalcomoracin生物合成過(guò)程中關(guān)鍵的Diels-Alderase進(jìn)行分離純化。本論文的研究結(jié)果如下:
　　(1)Diels-Alderase分離純化的研究。光酶誘導(dǎo)桑葉與100mMpH=7.5的PBS緩沖液按照料液比1∶10的比例混合，破碎后并于4℃浸提2h

4、，12000g4℃離心20min，取上清經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀收集40-60％組分的蛋白，沉淀用含有0.8M硫酸銨的pH=7.5的PBS緩沖液復(fù)溶。通過(guò)疏水層析分離;收集30-50％組分;10kDa Centrifugal Filter Units于4500g4℃離心20min超濾置換緩沖液，過(guò)陰離子交換層析;取第4管組分超濾濃縮置換緩沖液，過(guò)陽(yáng)離子交換層析;取流穿組分過(guò)凝膠過(guò)濾層析。純化倍數(shù)增加，比活力顯著增加，回收率下降明顯，凝膠過(guò)濾層析

5、后蛋白純化倍數(shù)達(dá)25.29倍，蛋白回收率僅為0.04％。獲得的高純度蛋白為目標(biāo)蛋白的解析奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)光酶誘導(dǎo)桑葉中Diels-Alderase的鑒定及克隆表達(dá)研究?；贚C-MS/MS的Diels-Alderase肽段序列鑒定，共得到27個(gè)候選蛋白。通過(guò)對(duì)蛋白條帶的MALDI-TOF/TOF鑒定，比對(duì)桑葉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，最終發(fā)現(xiàn)具有Diels-Alderase催化功能的蛋白可能為chloroplast sedoheptu

6、lose-1，7-bisphosphatase（SBPase:景天庚1，7-二磷酸酶）。SBPase開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為1179bp，含有392個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量大小為42521.55Da，等電點(diǎn)為5.96。應(yīng)用pET-19b載體，對(duì)SBPase進(jìn)行克隆表達(dá)，表達(dá)菌株為BL21;SDS-PAGE結(jié)果表明在37℃，1mM IPTG誘導(dǎo)4h時(shí)，有大量可溶性重組蛋白的表達(dá)。對(duì)重組蛋白進(jìn)行活性驗(yàn)證顯示:在FAD存在條件下，重組蛋白可非高效催化mo

7、racinC和morachalcone生成chalcomoracin。
　　本論文從光酶誘導(dǎo)桑葉中分離出電泳純的Diels-Alderase，經(jīng)MALDI-TOF/TOF和LC-MS/MS鑒定分析得到候選蛋白的氨基酸序列。并應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)疑似目標(biāo)蛋白進(jìn)行體外表達(dá)，并進(jìn)行了活性驗(yàn)證。確定了桑葉Diels-Alderase的篩選范圍，為chalcomoracin生物合成途徑的研究和chalcomoracin生物合成途徑中關(guān)鍵酶Di