胎鼠原代心肌細(xì)胞中miR-17-92基因簇對(duì)FOG-2基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用.pdf

1、人類(lèi)先天性心臟病由于在胚胎發(fā)育時(shí)期受到病毒感染、藥物、電離輻射以及遺傳等因素影響導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)或者功能的異常，其發(fā)病率大約為12‰。心臟發(fā)育是一個(gè)非常精細(xì)的過(guò)程，它由不同的心臟前體細(xì)胞如心肌細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、心內(nèi)膜細(xì)胞等分化發(fā)育而來(lái)。各種前體細(xì)胞在精細(xì)調(diào)控下發(fā)育成各腔室、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)以及瓣膜間隔系統(tǒng)。因此心臟發(fā)育過(guò)程中的精確調(diào)控對(duì)發(fā)育成正常結(jié)構(gòu)和功能的心臟而言至關(guān)重要。心臟發(fā)育過(guò)程中受很多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中FOG-2(又名zfpm2)為

2、多鋅指核輔阻遏蛋白，屬于GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，在心臟發(fā)育過(guò)程中必不可少。FOG-2與GATA因子結(jié)合后調(diào)節(jié)GATA因子依賴(lài)的轉(zhuǎn)錄活性，既可以作為激活子也可為抑制子，此取決于啟動(dòng)子和細(xì)胞類(lèi)型。FOG-2-/-基因敲出小鼠于胚胎期E13.5天左右因心臟缺陷導(dǎo)致胚胎期致死，其心臟發(fā)育缺陷主要包括心肌發(fā)育不良心室壁變薄、大的室間隔缺損、嚴(yán)重的房室心內(nèi)膜墊缺失、主動(dòng)脈騎跨和嚴(yán)重的冠狀動(dòng)脈血管叢發(fā)育不全。microRNAs(miRNAs)是近年來(lái)發(fā)

3、現(xiàn)的一種高度保守的非編碼單鏈微小RNA，約20余個(gè)核苷酸，通過(guò)特異性結(jié)合到與其種子序列互補(bǔ)配對(duì)的靶基因3’非翻譯區(qū)上降解靶基因mRNA或抑制該基因的翻譯，起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控該基因的作用。最近大量研究顯示miRNAs作為調(diào)節(jié)子在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但是目前為止miRNAs在調(diào)節(jié)心臟發(fā)育過(guò)程中的文獻(xiàn)報(bào)道并不多，并且研究顯示了大約30％的編碼基因均受miRNAs的調(diào)控。之前研究已經(jīng)證明FOG-2基因在心臟發(fā)育過(guò)程中具有非常重要的作用

4、。我們假設(shè)FOG-2基因在心臟發(fā)育過(guò)程中也可能受miRNAs的調(diào)控，基于此研究目的我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析了FOG-2基因的3'UTR全長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)有62個(gè)miRNAs可能和FOG-2基因的3'UTR相互作用，并且其中34個(gè)miRNAs可能可能和FOG-2基因3'UTR的17個(gè)保守的靶位點(diǎn)相互結(jié)合。34個(gè)miRNAs中又有5個(gè)miRNAs屬于miR-17-92基因簇中，這5個(gè)miRNAs又可能和3個(gè)保守的靶位點(diǎn)相互結(jié)合。這5個(gè)miRNA

5、s包括miR-17-5p、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a。并且目前有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-17-92在心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮很重要的調(diào)控作用。miR-17-92-/-基因敲出小鼠于出生后2小時(shí)內(nèi)死于心肺功能異常，心臟表型有心肌發(fā)育異常和間隔缺損。為了證實(shí)miR-17-92是否轉(zhuǎn)錄后調(diào)控FOG-2基因，我們首先通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)了miR-17-92各個(gè)miRNAs能否和FOG-2基因的3'UTR相互作用

6、。然后通過(guò)提取培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，Northern blotting方法檢測(cè)miR-17-92在心肌細(xì)胞的表達(dá)量，過(guò)表達(dá)miR-17-92后利用RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)了FOG-2基因的mRNA及蛋白表達(dá)變化情況。最后通過(guò)EdU及TUNEL方法分別檢測(cè)了心肌細(xì)胞增殖及凋亡情況。首先，熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)結(jié)果提示miR-17-92簇中miR-17-5p和miR-20a可以直接和FOG-2基因的3’UTR相互作用；然后檢

7、測(cè)原代心肌細(xì)胞miR-17-92簇各個(gè)miRNAs均有表達(dá)，并且轉(zhuǎn)染miR-17-92表達(dá)載體后檢測(cè)各個(gè)miRNAs表達(dá)量均明顯升高；接著我們?cè)谠募〖?xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-17-92后檢測(cè)了FOG-2基因的mRNA和蛋白水平的變化，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92后心肌細(xì)胞FOG-2基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，但蛋白水平明顯降低，提示miR-17-92轉(zhuǎn)錄后抑制了FOG-2基因的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-17-92后明顯抑制了心肌細(xì)胞