miRNA-17-92基因簇在肺腺癌多藥耐藥中作用的初步研究.pdf

1、【背景】
　　肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率極高的惡性腫瘤之一，其中約80％為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），在我國(guó)，約70%-80%的患者在確診時(shí)已為中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。因此，化學(xué)藥物治療成為中晚期NSCLC患者治療的主要手段。盡管新研發(fā)的藥物層出不窮，患者的5年生存率僅為10%-15%，最重要的一個(gè)原因就是肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥（multidrug resista

2、nce，MDR）。研究表明，非小細(xì)胞肺癌的多藥耐藥是一個(gè)多通道參與、多因素影響及多種蛋白介導(dǎo)的復(fù)雜過程。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)及蛋白組學(xué)研究手段的不斷發(fā)展，越來(lái)越多的肺癌耐藥分子被發(fā)現(xiàn)，然而，肺癌MDR的分子機(jī)制尚未完全闡明。
　　MicroRNA(miRNA)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA,長(zhǎng)度為19-25nt。miRNA主要通過在轉(zhuǎn)錄后水平與特異的靶mRNA的3＇UTRs（untrans

3、lated regions）結(jié)合使之降解或者抑制其翻譯,從而調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)。目前已經(jīng)鑒定的人類基因組中的miRNA數(shù)目已超過1000個(gè)。隨著對(duì)miRNA功能研究的深入,越來(lái)越多的研究成果發(fā)現(xiàn)，miRNA可能在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面起重要作用，并且在人類腫瘤形成及調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性方面也扮演者重要角色。因此，我們推測(cè)：miRNA可能參與某些耐藥基因及蛋白表達(dá)的調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。目前為止，mir-17-92

4、基因簇在NSCLC多藥耐藥中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。
　　【目的】
　　探討miR-17-92家族成員miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a在非小細(xì)胞肺癌MDR中的調(diào)節(jié)作用及分子機(jī)制，進(jìn)而更全面地闡明肺癌耐藥機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥提供理論依據(jù)。
　　【方法】
　　1.利用Real time RT-PCR對(duì)miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR

5、-106a的芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證；
　　2.通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染，用miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的寡核苷酸模擬物分別上調(diào)A549/DDP中miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達(dá)，miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR–106a特異的反義寡核苷酸抑制物分別下調(diào) A549細(xì)胞的mir-17/miR-20a/miR-20b/

6、miR-92b/miR-106a的表達(dá)；并檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。
　　3.通過CCK8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a對(duì)肺癌細(xì)胞耐藥株A549/DDP及非耐藥株A549體外藥物敏感性的影響，同時(shí)篩選出能影響藥物敏感性的microRNA。
　　4.通過CCK8實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè) miR-92b對(duì)化療藥物DDP、VP-16、VCR、ADM及5-FU的多藥耐藥效應(yīng)。
　　5.通過

7、生物信息學(xué)網(wǎng)站或軟件預(yù)測(cè)miR-92b調(diào)控的靶基因。
　　6.利用RT-PCR、Western blot、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-92b調(diào)控的靶基因；
　　【結(jié)果】
　　1.Real-time PCR結(jié)果顯示: miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達(dá)在耐藥株細(xì)胞A549/DDP較非耐藥株細(xì)胞A549中顯著降低，與芯片結(jié)果相符合。
　　2.體外藥物敏感性試驗(yàn)表

8、明，上調(diào)miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達(dá)，A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性顯著增加，而下調(diào)miR-17/miR-20a/miR-20b/miR-92b/miR-106a的表達(dá)后，只有miR-92b可降低A549細(xì)胞對(duì)DDP的敏感性。
　　3.因此，我們選擇miR-92b做為我們研究的microRNA，通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，從miR-92b調(diào)控的眾多靶基因中，挑選出DNA損傷修復(fù)

9、基因RAD21及REV3L作為研究的靶基因。
　　4.與對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-92b核苷酸模擬物的A549/DDP細(xì)胞的RAD21及REV3L mRNA,但蛋白水平未見明顯減低。轉(zhuǎn)染miR-92b反義寡核苷酸抑制物的A549細(xì)胞的RAD21及REV3L mRNA及RAD21的蛋白水平均表達(dá)上調(diào),miR-92b通過結(jié)合克隆于熒光素酶基因編碼區(qū)下游的RAD21及REV3L3’UTR的靶位點(diǎn)，抑制熒光素酶表達(dá)，而使靶點(diǎn)序列突變后可解