BMP9誘導(dǎo)永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目前在臨床中，由于創(chuàng)傷、腫瘤、退變及先天性等因素導(dǎo)致的骨缺損還很常見，雖然在骨重建中骨科內(nèi)固定和手術(shù)技術(shù)方面取得了很大的進(jìn)步，但通過(guò)手術(shù)進(jìn)行骨重建中還是會(huì)遇到很多的挑戰(zhàn)，比如自體骨量和供區(qū)的限制等。隨著再生醫(yī)學(xué)和骨組織工程的發(fā)展，給骨重建提供了一種新的選擇。
　　種子細(xì)胞、生物支架材料、生物活性因子是骨組織工程的三要素，其中種子細(xì)胞是骨組織工程的最基本的環(huán)節(jié)。種子細(xì)胞為再生醫(yī)學(xué)和組織工程提供活性成分的主要來(lái)源，是其核心部分。干細(xì)胞

2、作為具有多向分化潛能的特點(diǎn)，是目前應(yīng)用最廣泛的種子細(xì)胞。
　　顱骨骨縫組織具有很強(qiáng)的增殖能力，其在人生中的前三十年中顱骨的形成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。與一般長(zhǎng)骨軟骨下成骨方式不同的是顱骨骨縫組織的成骨主要是通過(guò)膜內(nèi)成骨。其成骨原理是在一定的刺激條件下其骨化位點(diǎn)通過(guò)重疊的成骨前緣間充質(zhì)干細(xì)胞的聚集、分化而進(jìn)一步成骨。研究表明顱骨骨縫干細(xì)胞具有一定的分化潛能。通過(guò)顱骨骨縫組織干細(xì)胞的研究，對(duì)進(jìn)一步研究膜內(nèi)成骨的機(jī)制和特點(diǎn)、探索為再生

3、醫(yī)學(xué)和組織工程良好的種子細(xì)胞具有重要意義，同時(shí)也為進(jìn)一步研究顱骨骨縫早閉等疾病有重要意義。
　　通常情況下正常的組織細(xì)胞，在體外培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)停滯，即M1期（衰老期），細(xì)胞繼續(xù)增殖后會(huì)進(jìn)入增殖抑制狀態(tài)，即M2期（危機(jī)期），隨后細(xì)胞逐漸出現(xiàn)退化、死亡。這些情況同樣會(huì)發(fā)生在于細(xì)胞身上。這為再生醫(yī)學(xué)和組織工程細(xì)胞來(lái)源及研究帶來(lái)諸多限制，尤其是那些稀少、取材困難的細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞永生化可以使細(xì)胞獲得持續(xù)增殖的能力。為再生醫(yī)學(xué)

4、和組織工程提供了足夠的種子細(xì)胞，更有利于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　BMPs屬于TGF-β超家族，家族至少有20個(gè)成員，BMPs在大多數(shù)物種均有表達(dá)。BMPs在體內(nèi)具有廣泛的作用，除了廣為所知的誘導(dǎo)成骨分化的能力外，還參與多種組織和器官的形成和修復(fù)。多種BMPs被報(bào)道具有誘導(dǎo)成骨的能力，誘導(dǎo)成骨BMP2、BMP4、BMP6、BMP、BMP9的報(bào)道較多。課題組前期實(shí)驗(yàn)證明，BMP9在眾多BMPs中對(duì)骨間充質(zhì)干細(xì)胞具有最強(qiáng)的成骨誘導(dǎo)能力，同時(shí)

5、還有誘導(dǎo)成軟骨和成脂肪的能力。課題組前期研究亦證實(shí)，BMP9對(duì)多種不同部位來(lái)源的干細(xì)胞具有較好的多向誘導(dǎo)分化能力。因此，在顱骨骨縫干細(xì)胞研究中，我們?nèi)赃x擇BMP9作為細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞。
　　作為再生醫(yī)學(xué)和組織工程很重要的組成部分，材料科學(xué)的發(fā)展極大的推進(jìn)了再生醫(yī)學(xué)和骨組織工程的發(fā)展，越來(lái)越多科學(xué)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用得到了驗(yàn)證和推廣。目前對(duì)于骨組織材料的基本特性是能給細(xì)胞遷移、增殖和分化提供三維結(jié)構(gòu)環(huán)境，在一些承重

6、的組織中，它同樣可以起到暫時(shí)的機(jī)械結(jié)構(gòu)支撐作用。一個(gè)理想的支架材料需要滿足以下特點(diǎn):①骨組織材料的三維和多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)和代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸。②表面特性有利于細(xì)胞貼附、遷移、增殖和分化。③具有生物相容性，不會(huì)引起免疫反應(yīng)，在細(xì)胞/組織生長(zhǎng)過(guò)程中其生物降解率可控。1④其力學(xué)特性應(yīng)當(dāng)跟移植區(qū)域的組織相當(dāng)⑤應(yīng)當(dāng)具有可塑性。PCCN作為一種新型的支架材料，除了具備以上特點(diǎn)外，還具有溫敏可控塑形的特點(diǎn)。為了驗(yàn)證這種新型支架材料對(duì)骨及軟

7、骨修復(fù)中的作用，我們用PCCN復(fù)合BMP9誘導(dǎo)下的小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞體內(nèi)注射的方法來(lái)驗(yàn)證新型支架在組織工程中的作用。
　　目的:
　　1、運(yùn)用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)構(gòu)建永生化的小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞，并進(jìn)行干細(xì)胞標(biāo)志物鑒定。
　　2、比較SCCSs與iSCCSs細(xì)胞系的增殖率差異。
　　3、iSCCSs的逆轉(zhuǎn)永生化及體內(nèi)成瘤風(fēng)險(xiǎn)研究。
　　4、BMP9誘導(dǎo)永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞的體外分化潛能研究。
　

8、　5、BMP9誘導(dǎo)永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞并復(fù)合PCCN體內(nèi)分化初步研究。
　　方法:
　　1、選取1周大小的無(wú)菌CD1小鼠，麻醉起效后將小鼠斷頸處死，無(wú)菌操作暴露顱骨骨縫，取顱骨骨縫組織，采用Ⅰ型膠原酶溶解方法使細(xì)胞貼壁獲得原代細(xì)胞。用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)將永生化基因SV40T抗原轉(zhuǎn)染至原代細(xì)胞中，構(gòu)建永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞。
　　2、采用細(xì)胞免疫熒光染色的方法鑒定iSCCSs的間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物。
　　

9、3、通過(guò)體外培養(yǎng)觀察、結(jié)晶紫染色、WST-1等方法，比較永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞與原代細(xì)胞增殖能力的差異。
　　4、體外通過(guò)利用Flip/FRT重組系統(tǒng)，將永生化基因SV40T抗原敲除，通過(guò)體外培養(yǎng)觀察、結(jié)晶紫染色、WST-1及Touch-down qPCR等方法來(lái)鑒定iSCCSs的逆永生化;通過(guò)對(duì)裸鼠體內(nèi)注射iSCCSs后活體成像檢測(cè)來(lái)鑒定其有無(wú)體內(nèi)成瘤風(fēng)險(xiǎn)性。
　　5、利用腺病毒感染技術(shù)，用Ad-BMP2、Ad-BMP4

10、、Ad-BMP6 Ad-BMP7、Ad-BMP9分別對(duì)iSCCSs進(jìn)行感染，通過(guò)ALP染色、ALP活性讀數(shù)、茜素紅染色和Touch-down qPCR的方法比較多種BMP對(duì)iSCCSs的體外誘導(dǎo)成骨能力。
　　6、利用腺病毒感染技術(shù)，用Ad-BMP9分別感染實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)具有較強(qiáng)成骨能力的干細(xì)胞iCALs、iSCAPs、iMEFs及本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的iSCCSs，通過(guò)ALP染色及ALP活性讀數(shù)來(lái)大致比較各種細(xì)胞系BMP9誘導(dǎo)下的體

11、外成骨能力。
　　7、通過(guò)ALP染色和ALP活性讀數(shù)檢測(cè)BMP9誘導(dǎo)iSCCSs成骨分化時(shí)間相關(guān)性和劑量相關(guān)性;運(yùn)用免疫熒光染色的方法來(lái)鑒定BMP9誘導(dǎo)下的OCN的表達(dá);運(yùn)用油紅染色鑒定BMP9誘導(dǎo)下iSCCSs的成脂能力;運(yùn)用Alician Blue染色的方法檢測(cè)BMP9誘導(dǎo)下iSCCSs的成軟骨能力。應(yīng)用Touch-down qPCR來(lái)鑒定相關(guān)成骨、成脂、成軟骨基因的表達(dá)。
　　8、將Ad-BMP9誘導(dǎo)下iSCCSs采用

12、單純細(xì)胞和復(fù)合新型支架材料PCCN于裸鼠皮下注射和肌肉注射。通過(guò)Micro-CT掃描來(lái)檢測(cè)BMP9的體內(nèi)誘導(dǎo)成骨能力和支架材料PCCN在成骨中的作用。通過(guò)對(duì)成骨包塊石蠟切片的HE染色、Alician Blue染色、Trichrome染色來(lái)檢測(cè)BMP9體外誘導(dǎo)iSCCSs的成骨、成脂、成軟骨能力和PCCN的作用。
　　結(jié)果:
　　1、成功獲得原代小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞，并通過(guò)piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功構(gòu)建永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞

13、。
　　2、對(duì)iSCCSs進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)記物免疫熒光染色，結(jié)果顯示CD29(interginβ1)、CD73、CD113(prom1)、CD40、CD90(Thy1)、CD117(c-kit)、CD166(ALCAM)、CD105(Endglin)和BMPRII具有表達(dá)。證實(shí)了iSCCSs保持了間充質(zhì)干細(xì)胞的干細(xì)胞特性。
　　3、通過(guò)體外培養(yǎng)觀察、結(jié)晶紫染色、WST-1等方法證實(shí)與原代細(xì)胞相比，永生化后的小鼠扁骨骨縫干細(xì)胞

14、具有更強(qiáng)的增殖能力，這種增殖上的差異自培養(yǎng)后第一天即存在，并且在第三、五、七各個(gè)時(shí)間段均存在明顯差異。
　　4、體外通過(guò)利用Flip/FRT重組系統(tǒng)，將永生化基因SV40T抗原敲除，通過(guò)體外培養(yǎng)觀察、結(jié)晶紫染色、WST-1證實(shí):對(duì)照組（Ad-GFP組）細(xì)胞增殖能力仍然旺盛，而實(shí)驗(yàn)組Ad-Flip組細(xì)胞的增殖速度明顯變慢，在連續(xù)七天內(nèi)，增殖率一致維持在一個(gè)較低的水平。Touch-down qPCR結(jié)果SV40T抗原基因在實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)

15、明顯低于對(duì)照組。證實(shí)SV40T抗原基因能夠被敲除，細(xì)胞的永生化可以逆轉(zhuǎn)。
　　5、應(yīng)用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功構(gòu)建螢光蟲熒光素酶(Fluc)標(biāo)記的iSCCS細(xì)胞(iSCCSs-Fluc)。裸鼠體內(nèi)注射iSCCSs后活體成像檢測(cè)顯示在iSCCSs-Fluc注射后，5天的時(shí)候信號(hào)強(qiáng)烈，10天的時(shí)候信號(hào)較前出現(xiàn)衰減，到第15天的時(shí)候信號(hào)已經(jīng)基本消失。通過(guò)大致觀察皮下注射部位亦無(wú)腫瘤樣物生成。表明iSCCSs在體內(nèi)具有較強(qiáng)的增殖能力，

16、但是無(wú)成瘤的危險(xiǎn)。
　　結(jié)論:
　　1、利用piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)成功構(gòu)建永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞，永生化的小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞能夠長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行多代培養(yǎng)，并且永生化的小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞保持了間充質(zhì)干細(xì)胞干性。
　　2、永生化的小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞增殖率明顯高于原代細(xì)胞，并且其增殖活性可以因永生化基因SV40T抗原被Flip/FRT重組酶敲除而逆轉(zhuǎn);體內(nèi)注射正式永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞無(wú)成腫瘤傾向。
　　3、BMP9對(duì)

17、永生化小鼠顱骨骨縫細(xì)胞的誘導(dǎo)成骨能力在已知具有誘導(dǎo)成骨能力的BMP中是最強(qiáng)的，并且誘導(dǎo)成骨能力與BMP9具有劑量和時(shí)間相關(guān)性。
　　4、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與常見具有成骨分化潛能的細(xì)胞相比永生化小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞具有較強(qiáng)的成骨能力。
　　5、體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)小鼠顱骨骨縫干細(xì)胞具有向成骨、成軟骨、成脂肪分化的能力。
　　6、新型支架材料PCCN能夠給細(xì)胞黏附、增殖、分化提供較好的三維分層結(jié)構(gòu)，促進(jìn)BMP9誘導(dǎo)iSCCSs的