BMP9誘導永生化小鼠顱骨骨縫干細胞分化的初步研究.pdf

1、目前在臨床中，由于創(chuàng)傷、腫瘤、退變及先天性等因素導致的骨缺損還很常見，雖然在骨重建中骨科內固定和手術技術方面取得了很大的進步，但通過手術進行骨重建中還是會遇到很多的挑戰(zhàn)，比如自體骨量和供區(qū)的限制等。隨著再生醫(yī)學和骨組織工程的發(fā)展，給骨重建提供了一種新的選擇。
　　種子細胞、生物支架材料、生物活性因子是骨組織工程的三要素，其中種子細胞是骨組織工程的最基本的環(huán)節(jié)。種子細胞為再生醫(yī)學和組織工程提供活性成分的主要來源，是其核心部分。干細胞

2、作為具有多向分化潛能的特點，是目前應用最廣泛的種子細胞。
　　顱骨骨縫組織具有很強的增殖能力，其在人生中的前三十年中顱骨的形成過程中起著至關重要的作用。與一般長骨軟骨下成骨方式不同的是顱骨骨縫組織的成骨主要是通過膜內成骨。其成骨原理是在一定的刺激條件下其骨化位點通過重疊的成骨前緣間充質干細胞的聚集、分化而進一步成骨。研究表明顱骨骨縫干細胞具有一定的分化潛能。通過顱骨骨縫組織干細胞的研究，對進一步研究膜內成骨的機制和特點、探索為再生

3、醫(yī)學和組織工程良好的種子細胞具有重要意義，同時也為進一步研究顱骨骨縫早閉等疾病有重要意義。
　　通常情況下正常的組織細胞，在體外培養(yǎng)一段時間后，細胞會出現(xiàn)生長停滯，即M1期（衰老期），細胞繼續(xù)增殖后會進入增殖抑制狀態(tài)，即M2期（危機期），隨后細胞逐漸出現(xiàn)退化、死亡。這些情況同樣會發(fā)生在于細胞身上。這為再生醫(yī)學和組織工程細胞來源及研究帶來諸多限制，尤其是那些稀少、取材困難的細胞。通過細胞永生化可以使細胞獲得持續(xù)增殖的能力。為再生醫(yī)學

4、和組織工程提供了足夠的種子細胞，更有利于進行實驗研究。
　　BMPs屬于TGF-β超家族，家族至少有20個成員，BMPs在大多數(shù)物種均有表達。BMPs在體內具有廣泛的作用，除了廣為所知的誘導成骨分化的能力外，還參與多種組織和器官的形成和修復。多種BMPs被報道具有誘導成骨的能力，誘導成骨BMP2、BMP4、BMP6、BMP、BMP9的報道較多。課題組前期實驗證明，BMP9在眾多BMPs中對骨間充質干細胞具有最強的成骨誘導能力，同時

5、還有誘導成軟骨和成脂肪的能力。課題組前期研究亦證實，BMP9對多種不同部位來源的干細胞具有較好的多向誘導分化能力。因此，在顱骨骨縫干細胞研究中，我們仍選擇BMP9作為細胞因子進行誘導永生化小鼠顱骨骨縫干細胞。
　　作為再生醫(yī)學和組織工程很重要的組成部分，材料科學的發(fā)展極大的推進了再生醫(yī)學和骨組織工程的發(fā)展，越來越多科學實驗和臨床應用得到了驗證和推廣。目前對于骨組織材料的基本特性是能給細胞遷移、增殖和分化提供三維結構環(huán)境，在一些承重

6、的組織中，它同樣可以起到暫時的機械結構支撐作用。一個理想的支架材料需要滿足以下特點:①骨組織材料的三維和多孔網(wǎng)狀結構有利于細胞生長、營養(yǎng)和代謝產物的運輸。②表面特性有利于細胞貼附、遷移、增殖和分化。③具有生物相容性，不會引起免疫反應，在細胞/組織生長過程中其生物降解率可控。1④其力學特性應當跟移植區(qū)域的組織相當⑤應當具有可塑性。PCCN作為一種新型的支架材料，除了具備以上特點外，還具有溫敏可控塑形的特點。為了驗證這種新型支架材料對骨及軟

7、骨修復中的作用，我們用PCCN復合BMP9誘導下的小鼠顱骨骨縫干細胞體內注射的方法來驗證新型支架在組織工程中的作用。
　　目的:
　　1、運用piggyBac轉座系統(tǒng)構建永生化的小鼠顱骨骨縫干細胞，并進行干細胞標志物鑒定。
　　2、比較SCCSs與iSCCSs細胞系的增殖率差異。
　　3、iSCCSs的逆轉永生化及體內成瘤風險研究。
　　4、BMP9誘導永生化小鼠顱骨骨縫干細胞的體外分化潛能研究。
　

8、　5、BMP9誘導永生化小鼠顱骨骨縫干細胞并復合PCCN體內分化初步研究。
　　方法:
　　1、選取1周大小的無菌CD1小鼠，麻醉起效后將小鼠斷頸處死，無菌操作暴露顱骨骨縫，取顱骨骨縫組織，采用Ⅰ型膠原酶溶解方法使細胞貼壁獲得原代細胞。用piggyBac轉座系統(tǒng)將永生化基因SV40T抗原轉染至原代細胞中，構建永生化小鼠顱骨骨縫干細胞。
　　2、采用細胞免疫熒光染色的方法鑒定iSCCSs的間充質干細胞標志物。
　　

9、3、通過體外培養(yǎng)觀察、結晶紫染色、WST-1等方法，比較永生化小鼠顱骨骨縫干細胞與原代細胞增殖能力的差異。
　　4、體外通過利用Flip/FRT重組系統(tǒng)，將永生化基因SV40T抗原敲除，通過體外培養(yǎng)觀察、結晶紫染色、WST-1及Touch-down qPCR等方法來鑒定iSCCSs的逆永生化;通過對裸鼠體內注射iSCCSs后活體成像檢測來鑒定其有無體內成瘤風險性。
　　5、利用腺病毒感染技術，用Ad-BMP2、Ad-BMP4

10、、Ad-BMP6 Ad-BMP7、Ad-BMP9分別對iSCCSs進行感染，通過ALP染色、ALP活性讀數(shù)、茜素紅染色和Touch-down qPCR的方法比較多種BMP對iSCCSs的體外誘導成骨能力。
　　6、利用腺病毒感染技術，用Ad-BMP9分別感染實驗室前期已經(jīng)驗證過具有較強成骨能力的干細胞iCALs、iSCAPs、iMEFs及本實驗構建的iSCCSs，通過ALP染色及ALP活性讀數(shù)來大致比較各種細胞系BMP9誘導下的體

11、外成骨能力。
　　7、通過ALP染色和ALP活性讀數(shù)檢測BMP9誘導iSCCSs成骨分化時間相關性和劑量相關性;運用免疫熒光染色的方法來鑒定BMP9誘導下的OCN的表達;運用油紅染色鑒定BMP9誘導下iSCCSs的成脂能力;運用Alician Blue染色的方法檢測BMP9誘導下iSCCSs的成軟骨能力。應用Touch-down qPCR來鑒定相關成骨、成脂、成軟骨基因的表達。
　　8、將Ad-BMP9誘導下iSCCSs采用

12、單純細胞和復合新型支架材料PCCN于裸鼠皮下注射和肌肉注射。通過Micro-CT掃描來檢測BMP9的體內誘導成骨能力和支架材料PCCN在成骨中的作用。通過對成骨包塊石蠟切片的HE染色、Alician Blue染色、Trichrome染色來檢測BMP9體外誘導iSCCSs的成骨、成脂、成軟骨能力和PCCN的作用。
　　結果:
　　1、成功獲得原代小鼠顱骨骨縫干細胞，并通過piggyBac轉座系統(tǒng)成功構建永生化小鼠顱骨骨縫干細胞

13、。
　　2、對iSCCSs進行干細胞表面標記物免疫熒光染色，結果顯示CD29(interginβ1)、CD73、CD113(prom1)、CD40、CD90(Thy1)、CD117(c-kit)、CD166(ALCAM)、CD105(Endglin)和BMPRII具有表達。證實了iSCCSs保持了間充質干細胞的干細胞特性。
　　3、通過體外培養(yǎng)觀察、結晶紫染色、WST-1等方法證實與原代細胞相比，永生化后的小鼠扁骨骨縫干細胞

14、具有更強的增殖能力，這種增殖上的差異自培養(yǎng)后第一天即存在，并且在第三、五、七各個時間段均存在明顯差異。
　　4、體外通過利用Flip/FRT重組系統(tǒng)，將永生化基因SV40T抗原敲除，通過體外培養(yǎng)觀察、結晶紫染色、WST-1證實:對照組（Ad-GFP組）細胞增殖能力仍然旺盛，而實驗組Ad-Flip組細胞的增殖速度明顯變慢，在連續(xù)七天內，增殖率一致維持在一個較低的水平。Touch-down qPCR結果SV40T抗原基因在實驗組的表達

15、明顯低于對照組。證實SV40T抗原基因能夠被敲除，細胞的永生化可以逆轉。
　　5、應用piggyBac轉座系統(tǒng)成功構建螢光蟲熒光素酶(Fluc)標記的iSCCS細胞(iSCCSs-Fluc)。裸鼠體內注射iSCCSs后活體成像檢測顯示在iSCCSs-Fluc注射后，5天的時候信號強烈，10天的時候信號較前出現(xiàn)衰減，到第15天的時候信號已經(jīng)基本消失。通過大致觀察皮下注射部位亦無腫瘤樣物生成。表明iSCCSs在體內具有較強的增殖能力，

16、但是無成瘤的危險。
　　結論:
　　1、利用piggyBac轉座系統(tǒng)成功構建永生化小鼠顱骨骨縫干細胞，永生化的小鼠顱骨骨縫干細胞能夠長時間進行多代培養(yǎng)，并且永生化的小鼠顱骨骨縫干細胞保持了間充質干細胞干性。
　　2、永生化的小鼠顱骨骨縫干細胞增殖率明顯高于原代細胞，并且其增殖活性可以因永生化基因SV40T抗原被Flip/FRT重組酶敲除而逆轉;體內注射正式永生化小鼠顱骨骨縫干細胞無成腫瘤傾向。
　　3、BMP9對

17、永生化小鼠顱骨骨縫細胞的誘導成骨能力在已知具有誘導成骨能力的BMP中是最強的，并且誘導成骨能力與BMP9具有劑量和時間相關性。
　　4、體外實驗證實，與常見具有成骨分化潛能的細胞相比永生化小鼠顱骨骨縫干細胞具有較強的成骨能力。
　　5、體內、體外實驗都證實小鼠顱骨骨縫干細胞具有向成骨、成軟骨、成脂肪分化的能力。
　　6、新型支架材料PCCN能夠給細胞黏附、增殖、分化提供較好的三維分層結構，促進BMP9誘導iSCCSs的