核小體在DNA降解過程中的作用及其法醫(yī)學應用研究.pdf

1、目的:高度降解DNA的分型問題一直是法醫(yī)DNA檢驗的難點。大規(guī)模災難性事件、命案現(xiàn)場、恐怖襲擊后的個人識別工作，多涉及高度腐敗降解檢材的檢測與分析。高溫、潮濕、紫外輻射、土壤微生物、強酸和強堿等因素都會使檢材中的DNA分子被損壞，從而發(fā)生斷裂，分子變小，大片段丟失，堿基缺失，堿基修飾，因此減少了生物檢材中完整的目標片段含量，導致PCR擴增不良，甚至擴增失敗或目標基因座錯誤分型。本研究從構成染色質DNA的固有性質出發(fā)尋找檢測降解檢材的突破

2、口，使用IlluminaHiseq2000 Genome Analyser分析平臺獲得人類白細胞核小體定位信息和核小體核心區(qū)域遺傳標記信息。通過比較核小體核心DNA區(qū)與非核小體核心DNA區(qū)內遺傳標記在降解DNA中的差別，來探討核小體對降解DNA的檢驗影響，以期在確定其有抗降解性的前提下，開發(fā)更利于降解檢材分析的核小體遺傳標記體系。從而為降解DNA的檢驗提供全新的技術手段及發(fā)展方向。
　　方法:1.從健康人外周血收集白細胞，使用微球

3、菌核酸酶進行消化提取核小體核心區(qū)DNA。使用Illumina Hiseq2000 Genome Analyser分析平臺對獲得的核小體核心區(qū)DNA進行測序，獲得數(shù)據產出總量，測序覆蓋度等測序數(shù)據概況。對獲得的DNA測序數(shù)據中SNPs、Indels、STRs這三種遺傳標記的分布情況進行分析，篩選出位于核心區(qū)與非核心區(qū)內的遺傳標記;
　　2.對篩選出的位于核小體核心DNA區(qū)域內的法醫(yī)學常用STRs，以相同數(shù)目的非核心DNA區(qū)域內法醫(yī)學

4、常用STRs為對照，通過進一步設計引物使擴增片段長度小于147bp，使用實時熒光定量的方法和毛細管凝膠電泳分析技術對人工降解檢材和實際案件檢材進行分析，比較核小體不同區(qū)域內法醫(yī)學常用遺傳標記的抗降解性差異。
　　3.對第一部分獲得的未經報道的核小體STR候選基因座進行群體遺傳學調查和法醫(yī)學參數(shù)評價，將最終篩選的具有法醫(yī)學應用潛力的未經報道的核小體STR基因座與第二部驗證的具有良好抗降解性的核小體法醫(yī)學常用STR基因座，一并構建核小

5、體STR復合擴增體系。比較該體系與MiniFilerTM試劑盒在降解檢材檢測中的差異，同時將核小體STR復合擴增體系與MiniFilerTM試劑盒中各基因座測序所獲核小體定位信息與核小體軟件(NuScore軟件)預測結果進行比較，進一步分析測序對于獲得準確核小體遺傳標記的重要性。
　　結果:1.第一部分結果:①測序所獲數(shù)據概況:成功提取了人類血液白細胞內核小體核心DNA并進行了Solexa高通量測序，總共獲得reads數(shù)目為17，

6、752，5592×100雙末端reads，讀長為101bp。其中可比對到基因組唯一位置reads數(shù)目為26，750，300，占可比對數(shù)目的75.34％。實驗所獲reads的平均GC含量為52％，平均基因組覆蓋率約為34％(1042463676/3095693983)，其中22號染色體覆蓋率最低，為27％;X染色體覆蓋率最高，可達52％。測序深度可達3×。通過測序reads與參考基因組(human genome，hg19)比對所獲read

7、s中大多數(shù)分布在intergenic和intronic區(qū)域內，分別達到了52.5％和38.8％。②所獲測序reads中核小體遺傳標記概況:本研究共篩選到至少有10條reads支持的單核苷酸變異(single nucleotide variations，SNVs)共2462個，至少有10條reads支持的插入缺失位點（Insertion-deletion polymorphisms，indels）128個，其中大部分遺傳標記位于inter

8、genic區(qū)域。在檢測到的2462個SNVs中有2220個SNVs在dbSNP_138數(shù)據庫中存在記錄，242個SNVs為該樣本特有，不存在于dbSNP_138數(shù)據庫中。在檢測到的128個indels中有89個indels在dbSNP_138數(shù)據庫中存在記錄，39個indels為該樣本特有，不存在于dbSNP_138數(shù)據庫中。使用兩種方法對所獲reads中STRs進行篩選。將獲得的reads中的STR與法醫(yī)學常用的44個STRs進行比對

9、。共有5個STRs被篩選到，即TH01、TPOX、D18S51、DYS391和D10S1248。通過編寫程序進行STR的分析。從兩個角度進行了編程篩選。編程方法1側重于篩選所得STR位于核小體線性定位的中心部分;編程方法2側重于篩選所得STR位于測序深度較高的reads部分。當滿足編程篩選方法1全部條件時共篩選到10167個STRs;當滿足編程篩選方法2的前4個條件時篩選到295126個STRs，當滿足全部5個條件時可見有468種重復序

10、列入選。兩種方法均包括使用方法一篩選到的5個法醫(yī)學常用STRs即TH01、TPOX、D18S51、DYS391和D10S1248。
　　2.第二部分結果:①選擇第一部分篩選的5個核小體法醫(yī)學常用STRs（D10S1248、D18S51、TH01、TPOX和DYS391）和5個非核小體法醫(yī)學常用STRs（CSF1PO、 D5S818、D8S1179、D16S539和DYS392）進行抗降解性比較。②Mann-Whitney U Te

11、st分析顯示兩組擴增子片段長度無差異。③實時熒光定量結果顯示伴隨著DNaseⅠ消化時間的增加，在5例人工降解檢材中各基因座的含量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。重復測量方差分析和多元方差分析對各時間點核小體組STRs和非核小體組STRs基因座含量分析結果顯示在5min、10min、20min時，被分析的5例人工降解檢材中核小體組STRs與非核小體組STRs均存在差異。④毛細管凝膠電泳結果顯示在20例人工降解檢材中，經Mann-Whitney U

12、Test分析核小體組STRs基因座檢出率明顯高于與非核小體組STRs(P=0.001＜0.05)。在20例人工降解檢材中，核小體組STRs基因座平均檢出率為64.75％，非核小體組STRs基因座平均檢出率為26.75％。在被分析的10個STRs中，位于核小體組的D10S1248基因座更容易被毛細管凝膠電泳檢測到（在20例人工降解檢材中該基因座檢出率達到了100％）。D18S51基因座是核小體組內檢出率最低的一個基因座，其檢出率低于60％

13、。非核小體組內基因座檢出率普遍較低，達到了10％至45％之間。在12例福爾馬林固定樣本中，核小體組檢出率明顯高于非核小體組(P=0.008＜0.05)。核小體組基因座平均檢出率為50％;非核小體組的平均檢出率為27％。在核小體組中隨著固定時間的延長檢出率有明顯下降的趨勢，非核小體組隨著固定時間的延長檢出率基本無變化，但不論固定時間長短，核小體組檢出率均明顯高于非核小體組。在被分析的5個核小體組STRs中，4個STRs基因座(TPOX、T

14、H01、D10S1248、DYS391)檢出率較高，可以作為第三部分復合擴增體系構建的候選基因。
　　3.第三部分結果:①篩選到2個具有法醫(yī)學應用潛力的未經報道的核小體STR基因座（AC012568.7和AC007160.3），兩個基因座在河北漢族人群中的雜合度觀察值分別是0.648和0.722，多態(tài)信息含量分別是0.52和0.59，個人識別能力分別為0.755和0.787，非父排除力為0.353和0.463。②成功構建了5個包含

15、核小體STRs(TPOX，TH01，D10S1248，AC012568.7和AC007160.3)的核小體復合擴增體系。③結果顯示MiniFilerTM(＜147bp)組各基因座核小體形成潛力高于核小體復合體系中各基因座。結果提示較軟件預測方法，大規(guī)模測序技術篩選核小體核心區(qū)域遺傳標記更為準確，更貼近法醫(yī)學實踐需求。
　　結論:1.本研究應用新一代高通量測序技術對人類血液白細胞核小體核心DNA進行測序，經過生物信息學分析，篩選出位

16、于核小體核心區(qū)域的SNVs共2462個，Indels128個，STRs10167（編程篩選方法1）和295126個（編程篩選方法2），其中包括5個法醫(yī)學常用STRs(TH01，TPOX，D18S51,DYS391和D10S1248)。
　　2.該5個法醫(yī)學常用核小體STR基因座對DNase消化的降解DNA及福爾馬林固的降解檢材的檢出成功率明顯高于非核小體STR基因座，說明核小體對DNA的確具有保護作用，是用于高度降解檢材DNA檢驗

17、的優(yōu)選遺傳標記。
　　3.最后，本研究成功構建了包括5個核小體STRs(TPOX、TH01、D10S1248、AC007160.3和AC012568.7)的復合分型體系，該復合分型體系無論對人工降解DNA還是福爾馬林固定檢材，均具有較高的檢出率，明顯高于MiniFilerTM試劑盒。提示利用核小體這種保護作用研發(fā)核小體STR分型體系，可以為解決高度降解DNA分型難題提供了新思路和新策略。
　　4.通過比較大規(guī)模測序篩選結果與