SCA3患者皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體形態(tài)變化與iPSCs的構(gòu)建.pdf

1、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)3型(Spinocerebellar Ataxia Type3/SCA3)又稱馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease/MJD)，是常染色體顯性遺傳性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)最常見(jiàn)亞型，在中國(guó)的患病率約為3～5/10萬(wàn)。該病是由位于14q32.1上的ATXN3基因CAG三核苷酸異常重復(fù)擴(kuò)增引起的疾病，是目前已發(fā)現(xiàn)的9種由CAG三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增引起疾病中的一種。該病的主要臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的小腦性共濟(jì)失調(diào)、

2、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙，可伴有眼球震顫，吞咽障礙以及感覺(jué)異常等，當(dāng)前尚無(wú)有效的治療方法。
　　SCA3的確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，既往的研究表明包涵體形成、蛋白質(zhì)質(zhì)量控制系統(tǒng)功能的異常、神經(jīng)元軸突運(yùn)輸障礙、細(xì)胞氧化應(yīng)激功能障礙、細(xì)胞自噬和凋亡的障礙、線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常等均可能參與了SCA3的發(fā)病。
　　高爾基體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，主要參與對(duì)部分脂質(zhì)以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成蛋白質(zhì)的加工、修飾、分類、包裝與運(yùn)輸，高爾基體在細(xì)胞尤其是

3、神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮重要作用。研究表明高爾基體結(jié)構(gòu)和功能的異常參與了肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、阿爾茲海默病(AD)、脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型(SCA2)等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程，高爾基體碎裂可能是細(xì)胞凋亡的不可逆病理表現(xiàn)。當(dāng)前，在SCA3發(fā)病過(guò)程中，細(xì)胞高爾基體形態(tài)的變化以及高爾基體是否參與SCA3的發(fā)病過(guò)程鮮有報(bào)道。
　　誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)是一類與胚胎干細(xì)胞具有類似形態(tài)和生物學(xué)功能的細(xì)胞，是由日本科

4、學(xué)家山中彌伸于2006年通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體細(xì)胞重編程建立。與胚胎干細(xì)胞類似，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可在體外進(jìn)一步分化為各類組織細(xì)胞，患者來(lái)源的iPSCs可為研究疾病的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、基因編輯和細(xì)胞移植治療提供理想的細(xì)胞模型。
　　本研究通過(guò)檢測(cè)SCA3患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞中ataxin-3蛋白、高爾基體蛋白GM130的表達(dá)情況，初步探討了SCA3患者來(lái)源皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體的形態(tài)的變化，并成功的構(gòu)建了患者皮膚成纖維細(xì)胞來(lái)源的誘

5、導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，為后續(xù)分化獲得患者來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞用于進(jìn)一步探討該病的發(fā)病機(jī)制和藥物篩選等奠定了基礎(chǔ)。
　　目的：
　　檢測(cè)SCA3患者皮膚成纖維細(xì)胞中高爾基體形態(tài)的變化，構(gòu)建患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)。
　　方法：
　　1.采用機(jī)械分離法培養(yǎng)SCA3患者與健康志愿者的皮膚成纖維細(xì)胞;
　　2.CCK8細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞活力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平，分別采用配對(duì)t

6、檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
　　3.免疫熒光法標(biāo)記皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體蛋白GM130，觀察高爾基體形態(tài)，計(jì)數(shù)高爾基體碎裂的細(xì)胞數(shù)，x2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
　　4.Western-blot檢測(cè)皮膚成纖維細(xì)胞ataxin-3，GM130的蛋白表達(dá)，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析;
　　5.透射電鏡驗(yàn)證皮膚成纖維細(xì)胞高爾基體形態(tài)的改變;
　　6.采用仙臺(tái)病毒轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);

7、r>　　7.堿性磷酸酶染色、核型分析、免疫熒光、流式細(xì)胞、畸胎瘤形成等鑒定患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs);
　　8.毛細(xì)管電泳法檢測(cè)患者來(lái)源的iPSCs中ATXN3基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)機(jī)械分離法法成功的建立了SCA3患者與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞;
　　2.患者來(lái)源的皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)突變的ataxin-3蛋白，與健康志愿者皮膚成纖維細(xì)胞相比活力降低（t=2.889，p=0.045）

8、，凋亡增加(t=-5.159，p=0.007)，高爾基體碎裂增多（x2=16.61，p＜0.01），GM130表達(dá)量降低(t=43.658，p＜0.01);
　　3.SCA3患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，具有正常的二倍體核型，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4、Nanog和TRA-1-60，在NOD-SCID小鼠體內(nèi)能成功的分化為具有三胚層結(jié)構(gòu)的畸胎瘤;
　　4.患者來(lái)源的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)攜帶