氧糖剝奪再灌注后高爾基體的形態(tài)變化及其可能機制的探討.pdf

1、本文從以下三部分進行了論述。
　　第一章氧糖剝脫再灌注后高爾基體的形態(tài)變化。
　　目的:探討氧糖剝脫再灌注后高爾基體的形態(tài)變化以及其結(jié)構(gòu)蛋白GM130的表達。
　　方法:以小鼠神經(jīng)瘤母細胞株N2a細胞為研究對象，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注過程后，采用CCK-8法檢測細胞活力，TUNEL熒光染色法評估細胞凋亡，并應(yīng)用免疫細胞化學(xué)方法觀察高爾基體的形態(tài)變化，應(yīng)用Western blot技術(shù)檢測GM130和磷酸化GM130(phos

2、pho-GM130)的蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.CCK-8法顯示，氧糖剝奪后再灌注6小時、12小時、24小時和48小時，細胞活力均明顯降低，與正常組之間比較，具有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);
　　2.TUNEL熒光染色結(jié)果顯示，與正常組相比，氧糖剝奪4小時和再灌注6小時的凋亡細胞比率較少(P＞0.05)，而再灌注12小時、24小時和48小時的凋亡細胞比率逐漸增高(P＜0.05)，再灌注48小時組凋亡細胞比率

3、最高(P＜0.05);
　　3.免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，再灌注24小時，高爾基體出現(xiàn)腫大，失去原有形態(tài)，結(jié)構(gòu)松散，少量囊膜斷裂，而再灌注48小時后，高爾基體的正常形態(tài)被破壞，出現(xiàn)明顯碎裂，呈碎片狀或顆粒狀，散在于細胞內(nèi);
　　4.Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，氧糖剝奪4小時以及再灌注6小時、12小時、24小時的總GM130蛋白表達水平無明顯改變(P＞0.05)，再灌注48小時，細胞內(nèi)總GM130的蛋白表達出現(xiàn)

4、下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而正常組、氧糖剝奪4小時組以及再灌注6小時組細胞內(nèi)phospho-GM130基本不表達，再灌注12小時組有少量表達(P＞0.05)，再灌注24小時和48小時，細胞內(nèi)phospho-GM130的表達明顯增多，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.氧糖剝奪再灌注損傷引起高爾基體碎裂;
　　2.氧糖剝奪再灌注后，磷酸化GM130蛋白的表達增加，可能與

5、高爾基體的形態(tài)損害有關(guān)。
　　第二章 Cdk1抑制劑對氧糖剝奪再灌注后高爾基體形態(tài)的影響。
　　目的:Cdk1抑制劑抑制GM130的磷酸化，探討氧糖剝奪再灌注后GM130磷酸化對高爾基體形態(tài)的影響。
　　方法:以N2a為對象，經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，應(yīng)用Western blot和Real time PCR技術(shù)檢測各時間點Cdk1的蛋白和mRNA變化;Cdk1抑制劑Purvalanol A干預(yù)細胞后，經(jīng)氧糖剝奪再灌注，CC

6、K-8法檢測細胞活力，免疫細胞化學(xué)技術(shù)觀察高爾基體的形態(tài)改變，免疫熒光共聚焦研究GM130和phospho-GM130在細胞內(nèi)的定位和表達，Westernblot技術(shù)檢測Purvalanol A干預(yù)后各組Cdk1、GM130和phospho-GM130的蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，Western blot結(jié)果提示，再灌注12小時、24小時、48小時后，Cdk1的蛋白表達明顯增高(P＜0.05);Re

7、al time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cdk1 mRNA在氧糖剝奪4小時、再灌注6小時出現(xiàn)明顯下降(P＜0.05)，而在再灌注12小時、24小時和48小時出現(xiàn)顯著上升(P＜0.05);
　　2.CCK-8法結(jié)果顯示，應(yīng)用Purvalanol A干預(yù)后，再灌注24小時和48小時，N2a細胞的活力出現(xiàn)降低(P＜0.05);
　　3.免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示，Purvalanol A干預(yù)后，氧糖剝奪4小時以及再灌注6小時、12小時、24小時

8、，高爾基體形態(tài)基本維持正常，直到再灌注48小時，可見部分細胞內(nèi)高爾基體腫脹，結(jié)構(gòu)松散，并有少量碎裂片段;
　　4.免疫熒光共聚焦結(jié)果顯示，phospho-GM130和GM130在細胞內(nèi)的定位和分布高度重合;未予Purvalanol A干預(yù)時，N2a細胞經(jīng)氧糖剝奪再灌注后，再灌注12小時、24小時和48小時組細胞內(nèi)phospho-GM130表達明顯增多;而Purvalanol A干預(yù)后，各組細胞內(nèi)phospho-GM130的表達明顯

9、減少;
　　5.Western blot結(jié)果顯示，Purvalanol A干預(yù)后，N2a細胞經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，Cdk1在各組的表達均受到了明顯抑制，同樣phospho-GM130在各組的表達亦均很少(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.氧糖剝奪再灌注后期Cdk1表達增多，抑制Cdk1可以減少GM130的磷酸化;
　　2.Cdk1抑制劑可以減輕氧糖剝奪再灌注后高爾基體的形態(tài)損害，其機制可能與下調(diào)GM130磷酸

10、化水平有關(guān)。
　　第三章靶向抑制Cdk1基因?qū)ρ跆莿儕Z再灌注后高爾基體形態(tài)的影響。
　　目的:構(gòu)建靶向抑制Cdk1基因的shRNA，進一步探討Cdk1對氧糖剝奪再灌注后高爾基體形態(tài)的影響。
　　方法:設(shè)計3條靶向抑制Cdk1基因的shRNA，構(gòu)建重組質(zhì)粒，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染進入N2a細胞內(nèi)，應(yīng)用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，Western Blot和Real time PCR檢測轉(zhuǎn)染后Cdk1的蛋白表達和mRNA含量，

11、篩選能獲得最大抑制效率的shRNA表達質(zhì)粒。在此基礎(chǔ)上，細胞分為轉(zhuǎn)染陽性重組質(zhì)粒Cdk1-shRNA-1的實驗組、轉(zhuǎn)染陰性質(zhì)粒Cdk1-shRNA NC的陰性對照組和未轉(zhuǎn)染的空白對照組。各組經(jīng)歷氧糖剝奪再灌注后，應(yīng)用免疫細胞化學(xué)技術(shù)觀察高爾基體的形態(tài)變化，Western blot檢測各組Cdk1、GM130和phospho-GM130的蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　1.設(shè)計干擾Cdk1基因靶點的shRNA序列，并成功連接到hU

12、6-GFP-SV40-Neomycin表達載體中，經(jīng)酶切和測序鑒定插入位置正確;
　　2.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Cdk1 mRNA的變化:重組質(zhì)粒組細胞(Cdk1-shRNA-1、Cdk1-shRNA-2、Cdk1-shRNA-3)的Cdk1 mRNA抑制率分別為92.0±12.3％、76.3±10.2％、43.2±2.6％，其中，Cdk1-shRNA-1組的Cdk1 mRNA含量最低;
　　3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Cdk1蛋白的變化:與

13、空白對照組相比，重組質(zhì)粒組細胞(Cdk1-shRNA-1、Cdk1-shRNA-2、Cdk1-shRNA-3)的Cdk1蛋白的表達量抑制率分別為73.1±3.3％、33.7±8.6％和4.3±8.3％，其中，Cdk1-shRNA-1組的Cdk1蛋白表達抑制最明顯;
　　4.轉(zhuǎn)染陽性質(zhì)粒Cdk1-shRNA-1的實驗組細胞在氧糖剝奪再灌注后，高爾基體形態(tài)基本正常，僅在再灌注48小時觀察到少量細胞內(nèi)高爾基體出現(xiàn)腫脹和輕度碎裂;