基于肝素酶單克隆抗體的腫瘤分子顯像及其抗腫瘤效應的實驗研究.pdf

1、背景及目的：
　　 腫瘤轉移是腫瘤患者死亡的主要原因，是制約臨床治療效果的一種惡性生物學行為。目前針對腫瘤早期轉移的檢測沒有很好的方法，B 超、CT和MRI等是目前診斷腫瘤轉移的重要手段，但只能對一定大小的轉移瘤做出正確的診斷，且此時患者多發(fā)生轉移，失去了手術治療的最佳時機。因此，尋找能夠早期診斷腫瘤轉移的技術日益重要。
　　 近年來，分子影像學(Molecular Imaging)的發(fā)展為腫瘤的早期診斷及治療開辟了新的

2、領域。磁共振(MR)分子成像是分子影像學的重要領域之一，超順磁性分子探針的出現(xiàn)使其作為強大的信號擴增系統(tǒng)，大大提高了MR 檢測靶向?qū)Ρ葎┑拿舾行?。國?nèi)外已有研究者采用順磁性離子復合物或磁性微粒結合單克隆抗體(mAbs)，選擇性的改變腫瘤的弛豫時間。目前發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關抗原多具有組織特異性，如AFP、PSA、CEA等，以這些抗原制備的抗體只適用于表達該類抗原的腫瘤分子影像診斷。因此尋找腫瘤組織共同、特異性的靶點一直是腫瘤分子顯像的研究熱點。

3、
　　 肝素酶(Heparanase，Hpa)作為唯一能裂解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，EMC)內(nèi)蛋白聚糖主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulufate proteoglycans，HSPG)的內(nèi)源性糖苷內(nèi)切酶，在轉移的惡性腫瘤中普遍存在，其表達水平的高低與腫瘤轉移及病人的預后密切相關。我們過去的研究表明，肝素酶可以作為一種腫瘤共有抗原用于腫瘤的免疫治療。那么，肝素酶是否可以作為一種腫瘤

4、共有抗原用于腫瘤的分子影像診斷？
　　 基于以上分析，本研究在前期成功制備基于肝素酶全長Cdna 序列的單克隆抗體的基礎上，采用分子影像學技術，以納米金磁微粒(30nm)為分子顯像對比劑，肝素酶單克隆抗體為靶向載體，構建HPA&GoldMag分子探針，用于體外、體內(nèi)分子顯像MR 研究，探討其應用的可行性及其在腫瘤轉移早期診斷中的意義。同時研究了肝素酶抗體體外抗腫瘤的生物效應，為肝素酶單克隆抗體在腫瘤分子影像診斷及其治療中的作用于

5、提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1、培養(yǎng)人肝癌HepG2、人胃癌SGC-7901、MKN45、人骨肉瘤U2OS、人乳腺癌MCF-7、人結腸癌SW480細胞株，采用Western blot技術，以HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS、MCF-7細胞總蛋白為樣本，對已制備的7 號、11號、12號3株人肝素酶單克隆抗體進行初步鑒定，篩選出能夠與肝素酶蛋白特異性結合的抗體，并采用免疫細胞化學技術

6、進一步驗證篩選出的抗體特異性。
　　 2、將納米金磁微粒作為MR 成像的對比劑，用其標記篩選出的12 號肝素酶單克隆抗體構建特異性MR分子探針HPA&GoldMag，通過原子力顯微鏡觀察納米金磁微粒偶聯(lián)抗體的能力，并通過細胞免疫熒光技術和流式細胞術等方法檢測探針與上述腫瘤細胞結合的活性和特異性；分離新鮮白細胞，與未標記抗體和已標記抗體的金磁微粒共同孵育，模擬體內(nèi)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬金磁微粒，探討影響白細胞吞噬金磁微粒的因素。

7、　　 3、應用3.0T 磁共振掃描儀并建立MR 掃描序列，觀察不同濃度的納米金磁微粒MR 成像情況，體外探討探針應用于各種腫瘤細胞成像的可行性；建立荷瘤裸鼠模型，對荷瘤裸鼠經(jīng)尾靜脈注射HPA&GoldMag 探針，在注射前、注射后分別行MR 掃描，觀察探針對腫瘤組織T2WI信號的影響，探討其用于體內(nèi)腫瘤MR 成像的可行性。
　　 4、通過Transwell 體外侵襲實驗觀察篩選出的肝素酶單克隆抗體對腫瘤轉移的抑制作用，探討其在

8、體外對腫瘤細胞侵襲轉移的抑制效果。
　　 結果：
　　 1、通過Western-blot技術和免疫細胞化學方法證實12 號肝素酶單克隆抗體與肝素酶蛋白結合的特異性最好。
　　 2、成功構建了HPA&GoldMag 特異性MR分子探針；原子力顯微鏡觀察標記抗體前后的納米金磁微粒，未標記抗體的納米金磁微粒粒徑大小約10個nm，標記抗體后金磁微粒的粒徑變?yōu)?0nm；激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)肝素酶陽性的HepG2、SGC

9、-7901、MKN45、U2OS、SW480細胞株與HPA&GoldMag 特異性結合，均可見較強的紅色熒光，而在肝素酶弱陽性的MCF-7細胞中紅色熒光最弱，正常小鼠IgG對照組各細胞系均為陰性；白細胞吞噬實驗的結果顯示，其吞噬金磁微粒量的多少與吞噬細胞濃度成正相關，并隨著吞噬細胞與金磁微粒共同孵育時間的增加其吞噬量隨之增加，大約在3h 左右吞噬量接近飽和；白細胞對30-50nm大小的金磁微粒吞噬量統(tǒng)計學顯示相差不大，P＞0.053、體

10、外研究證實，HPA&GoldMag 探針與各腫瘤細胞共同孵育后行MR 掃描結果發(fā)現(xiàn)，探針可顯著降低HepG2、SGC-7901、MKN45、SW480、U2OS細胞T2WI信號，略降低MCF-7細胞T2WI信號，而對HF細胞信號無顯著影響，對照組正常小鼠IgG偶聯(lián)的GoldMag對各腫瘤細胞MR信號均無顯著影響。
　　 4、體內(nèi)實驗證實，在注射探針2 h后SGC-7901細胞荷瘤裸鼠腫瘤組織T2WI信號強度較注射探針前顯著降低(

11、p＜0.05)。
　　 5、Transwell 體外侵襲實驗結果顯示，12 號肝素酶單克隆抗體在100μg時作用于HepG2、SW480、SGC-7901、U2OS和MKN45細胞48小時后，其穿膜細胞數(shù)與正常小鼠IgG對照組相比明顯減少(P＜0.05)，有統(tǒng)計學意義。
　　 結論：
　　 1、篩選鑒定的12 號肝素酶單克隆抗體可以與肝素酶蛋白特異性結合，采用納米金磁標記肝素酶單克隆抗體成功構建成的HPA&Gol