靶向EGFR二聚化界面單克隆抗體的體外抗腫瘤分析.pdf

1、目的：表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）是人表皮受體（Human epidermal receptor,HER；包含EGFR，HER2, HER3,HER4）家族的一員，在30％以上的上皮癌中過(guò)表達(dá)或異?；罨?，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展高度相關(guān)。EGFR陽(yáng)性腫瘤患者常表現(xiàn)為預(yù)后差、轉(zhuǎn)移快、對(duì)放療和化療抗拒和生存期短，因此EGFR是最熱門的抗瘤藥物靶點(diǎn)之一。靶向EGFR的藥物主要有單克隆

2、抗體和小分子酪氨酸激酶抑制劑二大類，但已上市藥物臨床反應(yīng)率低（低于30%）并常誘導(dǎo)耐藥，而這二種現(xiàn)象均與EGFR靶位點(diǎn)的變異及受體異源二聚化高度相關(guān)。二聚化是HER家族受體活化必須經(jīng)歷的途徑，并且參與二聚體形成的界面區(qū)域是高度保守的區(qū)域，因此，我們提出了EGFR二聚化界面靶向策略，并制備了一種直接靶向EGFR二聚化界面區(qū)β環(huán)的單克隆抗體（Antidimer5G9），意圖通過(guò)該類精準(zhǔn)靶向抗體解決EGFR變異和異源二聚化而帶來(lái)的臨床反應(yīng)率低

3、和耐藥問(wèn)題。為了客觀評(píng)價(jià)EGFR二聚化界面靶向策略的可行性，本研究主要考察了Antidimer5G9對(duì)不同HER過(guò)表達(dá)表型和不同二聚化模式腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制與抗同源或異源二聚化的作用。
　　內(nèi)容:
　　1.單克隆抗體Antidimer5G9制備與保存方法建立；
　　2.腫瘤細(xì)胞受體“過(guò)表達(dá)亞型”鑒定；
　　3.Antidimer5G9與腫瘤細(xì)胞表面EGFR特異性結(jié)合分析；
　　4.Antidimer5G9對(duì)

4、不同受體“過(guò)表達(dá)亞型”腫瘤細(xì)胞的抑制活性分析；
　　5.抗二聚化分析
　　方法：
　　1.單克隆抗體Antidimer5G9制備與保存方法建立；
　　體內(nèi)誘生法在BALB/c小鼠內(nèi)獲得大量的腹水型單抗，用辛酸硫酸法純腹水單抗后，protein A柱精純單抗，分子篩G25置換為PBS溶液（ph7.4,10mM）, BCA法測(cè)定單抗的濃度后加入終濃度10%的甘油及1:100加入酶抑制劑混合液，混勻，分裝置于-80℃超

5、低溫冰箱。
　　2．腫瘤細(xì)胞受體“過(guò)表達(dá)亞型”鑒定
　　當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80%豐度時(shí)，提取總蛋白。采用SDS-PAGE, Western Blot的方法測(cè)定它們EGFR, HER2,HER3的表達(dá)水平。即，各細(xì)胞株取同等量（20μg）蛋白樣品按常規(guī)方法SDS-PAGE，濕法轉(zhuǎn)膜，一抗分別采用鼠抗人EGFR、HER2或HER3抗體，二抗采用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗兔抗體，化學(xué)發(fā)光法顯色，設(shè)β-Actin做內(nèi)標(biāo)蛋白。
　　3

6、.Antidimer5G9與腫瘤細(xì)胞表面EGFR特異性結(jié)合分析
　　選取EGFR過(guò)表達(dá)細(xì)胞株MDA-MB-231，將細(xì)胞按5x104個(gè)，接種于激光共聚焦皿中央，采用4%的多聚甲醛固定，1%BSA封閉，分別用Antidimer5G9及cetuximab作為一抗孵育后，相應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠和羊抗人抗體作二抗孵育，上機(jī)分析。
　　4.Antidimer5G9對(duì)不同受體“過(guò)表達(dá)亞型”腫瘤細(xì)胞的抑制活性分析
　　采用MTT

7、法檢測(cè)單克隆抗體Antidimer5G9對(duì)EGFR：EGFR過(guò)表達(dá)細(xì)胞株人乳腺癌細(xì)胞MM231，EGR:HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株人肺癌細(xì)胞H292，EGFR:HER2:HER3過(guò)表達(dá)細(xì)胞株人胰腺癌細(xì)胞BXPC-3以及EGFR正常表達(dá)的細(xì)胞株小鼠成纖維細(xì)胞3T3及EGFR陰性表達(dá)的細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞增殖抑制；
　　5.抗二聚化分析
　　EGFR:EGFR、EGFR:HER2和EGFR:HER3等3種代表性模式細(xì)胞，采用化學(xué)交聯(lián)劑

8、DTSSP共價(jià)交聯(lián)膜表面受體二聚體拍檔。細(xì)胞在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至80%豐度后，血清饑餓24h，按200μg/ml濃度加入抗體，保溫1h，用5μg/ml EGF10min后用偶聯(lián)劑DTSSP對(duì)細(xì)胞表面的二聚體原位化學(xué)偶聯(lián)。Western blot方法分析EGFR同源或異源二聚體形成情況。一抗分別采用鼠抗人EGFR、羊抗兔HER2或HER3抗體。用SDS-PAGE, Western blot的檢測(cè)方法比對(duì)研究Antidimer59G與西妥昔

9、抗EGFR同源和異源二聚化作用的能力。
　　結(jié)果：
　　1.單抗Antidimer5G9的生物學(xué)特性
　　本實(shí)驗(yàn)前期用流式細(xì)胞細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，單抗Antidimer5G9可與MM231細(xì)胞表面的EGFR特異性的結(jié)合，誘導(dǎo)MM231細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用激光共聚焦顯微鏡觀察，F(xiàn)ITC標(biāo)記。結(jié)果顯示，單抗Antidimer5G9可有效與細(xì)胞表面結(jié)合，且結(jié)合反應(yīng)顯示出明顯的“劑量依賴性”。
　　2.受體“過(guò)表達(dá)亞型”鑒

10、定
　　通過(guò)Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3T3細(xì)胞為EGFR，HER2，HER3弱表達(dá)，MM231和H292為EGFR中度表達(dá)，BXPC-3為EGFR高度表達(dá)；H292和BXPC-3為HER2高度表達(dá)，MM231為EGFR不表達(dá)；BXPC-3為HER3高度表達(dá)，而MM231和H292為HER3弱表達(dá)。
　　3.單抗Antidimer5G9對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用
　　經(jīng)辛酸-硫酸銨法粗純，protein A柱

11、精純的腹水單抗，純度達(dá)到95%以上，體外抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Antidimer5G9對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)的典型細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞有明顯的抑制作用，抑制率高達(dá)62.24%，且呈現(xiàn)“劑量依賴型”，顯示出了高于上市抗體“西妥昔”的抑瘤活性。對(duì)不同EGFR表型的細(xì)胞生長(zhǎng)具有不同的抑制效應(yīng)，對(duì)EGFR過(guò)表達(dá)的細(xì)胞株MM231抑制率最高，達(dá)到63.23%；對(duì)EGFR:HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞株H292及EGFR:HER2：HER3過(guò)表達(dá)細(xì)胞株BXP

12、C-3的抑制率分別為58.76%和56.42%；而對(duì)EGFR正常表達(dá)細(xì)胞3T3細(xì)胞株及EGFR陰性表達(dá)細(xì)胞株MCF7未觀察到顯著的抑制作用（分別為4.83%，5.82%）。
　　4.比對(duì)分析單抗Antidimer5G9和CetuoximAb的抗二聚化能力
　　以化學(xué)交聯(lián)劑DTSSP,共價(jià)交聯(lián)膜上的參與二聚體形成的拍檔受體，采用非還原SDS-PAGE, Western Blot方法分析。結(jié)果表明，單抗Antidimer5G9及

13、西妥昔均能抑制MM231細(xì)胞EGFR同源二聚體的形成數(shù)量。單抗Antidimer5G9還可抑制BXPC-3的EGFR/HER2的異源二聚體的形成，而西妥昔單抗對(duì)異源二聚體無(wú)顯著的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　1.成功分離純化得到了單克隆抗體Antidimer5G9，它可以特異性的結(jié)合于細(xì)胞表面的EGFR，并有效抑制EGFR惡性過(guò)表達(dá)細(xì)胞的增殖，抗體和細(xì)胞的結(jié)合反應(yīng)和抑制效應(yīng)高度相關(guān)。
　　2.通過(guò)western blot

14、技術(shù)，鑒定本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的過(guò)表達(dá)亞型，MCF-7為EGFR陰性表達(dá)細(xì)胞，3T3細(xì)胞為EGFR正常表達(dá)的細(xì)胞，MDA-MB-231為EGFR過(guò)表達(dá)細(xì)胞，H292為EGFR，HER2過(guò)表達(dá)細(xì)胞，BXPC-3為EGFR,HER2，HER3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞。
　　3.通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)劑DTSSP,成功共價(jià)交聯(lián)膜上的形成二聚體的拍檔受體，采用western blot技術(shù)檢測(cè)了不同細(xì)胞的受體二聚化表型，其中MDA-MB-231為EGFR同源二聚體，B