CKIP-1對小鼠股骨不同結(jié)構(gòu)影響的研究.pdf

1、背景：
　　骨質(zhì)疏松癥是目前公認(rèn)的一種常見的慢性、衰老相關(guān)性骨骼疾病。在我國，影響著將近1億多人的身體健康和生活質(zhì)量，其涉及的人群廣、發(fā)病率高，但是治療效果并不令人十分滿意。同時，骨質(zhì)疏松與口腔頜面外科、口腔種植、口腔修復(fù)以及牙周病等多個學(xué)科聯(lián)系密切。無論是骨質(zhì)疏松、骨折、口腔修復(fù)、種植等疾病的治療，對其骨量和骨質(zhì)都有一定的要求，如何更好的提高骨量同時能夠改善骨質(zhì)對于骨質(zhì)疏松等骨疾病的治療有重要的意義。近年來興起的基因治療為骨質(zhì)疏

2、松疾病的康復(fù)帶來了希望。同時，越來越多的相關(guān)基因也被重視起來，包括CKIP-1等基因。
　　CKIP-1（Casein Kinase-2 Interaction Protein-1）近幾年被發(fā)現(xiàn)是骨形成的負(fù)調(diào)控基因。于2008年Nature Cell Biology報道CKIP-1基因敲除小鼠可以正常出生，其骨形成速率、骨量和骨礦密度顯著增高。但CKIP-1對骨組織不同結(jié)構(gòu)（松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨、軟骨）是如何影響的，尚未見報道。

3、　　目的：
　　本實驗通過CKIP-1基因敲除小鼠，對同窩同性別小鼠股骨進行比較，通過Micro-CT掃描、組織學(xué)染色和免疫組化等實驗方法，對比觀察CKIP-1基因敲除小鼠與野生型小鼠股骨不同結(jié)構(gòu)（松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨、軟骨）之間影響的差異。為進一步認(rèn)識該基因在骨形成和骨質(zhì)疏松等骨疾病治療中的作用提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、通過野生型（WT）與CKIP-1基因敲除（KO）小鼠飼養(yǎng)繁殖，在第12周分別對8對同窩雄性WT

4、和KO小鼠股骨的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨進行Micro-CT三維掃描分析與H&E染色，比較兩組小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨量的差異。
　　2、通過麗春紅三色染色，比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨中膠原含量總量的差異；通過天狼猩紅染色，比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨I型膠原占總膠原含量的比例的差異。
　　3、通過麗春紅三色染色，比較WT和KO小鼠股骨軟骨的差異。通過番紅O染色比較WT和KO小鼠股骨軟骨含量的差異。
　　4、通

5、過甲苯胺藍(lán)染色，比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨新生骨骨量與成骨細(xì)胞數(shù)量的差異。通過四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記，比較WT和KO小鼠股骨松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨骨礦化沉積率(MAR)的差異。
　　5、通過TRAP染色，比較WT和KO小鼠股骨生長板（GP），松質(zhì)骨（TB）以及皮質(zhì)骨（CB）部位破骨細(xì)胞數(shù)量的差異。
　　6、通過免疫組化染色，比較WT與KO小鼠股骨中CKIP-1、經(jīng)典WNT信號通路激活標(biāo)記物Axin2、成骨分化標(biāo)記蛋白C

6、OL I的分布及表達(dá)量的差異。
　　結(jié)果：
　　1、松質(zhì)骨Micro-CT結(jié)果分析顯示，KO組骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）和骨小梁厚度（Tb.Th）分別比WT組增加了3.9％、0.7（1/mm）、5.3×10-3（mm）；骨表面積與骨體積比（BS/BV）、骨小梁分離度（Tb.Sp）分別比WT組降低了24.4（1/mm）、0.04（mm）。皮質(zhì)骨Micro-CT結(jié)果分析顯示， KO組皮質(zhì)骨面積(Ct.Ar)

7、、皮質(zhì)骨內(nèi)徑周長(Ct.Id.Pm)、皮質(zhì)骨外徑周長(Ct.Od.Pm)、皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)、皮質(zhì)骨體積（Ct.BV）與WT組相比均無顯著性差異。H&E染色結(jié)果分析顯示，KO組骨小梁面積（Tb.Ar）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）、骨小梁寬度（Tb.Wi）分別比WT組增加了4.35％、0.7（1/mm）、5×10-3（mm）；KO組骨小梁分離度（Tb.Sp）比WT組降低了0.06（mm）；KO組皮質(zhì)骨厚度(Ct.Th)與WT組相比無顯著

8、性差異，HE染色結(jié)果與Micro-CT分析結(jié)果趨勢一致。
　　2、松質(zhì)骨麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示，KO組膠原總量（Tb.Col.Ar）比WT組增加了3.7％；皮質(zhì)骨麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示，KO組膠原總量（Ct.Col.Ar）無顯著性差異。天狼猩紅染色結(jié)果分析顯示，KO組松質(zhì)骨中I型膠原占總膠原含量的比例（Tb.Col I）、皮質(zhì)骨中I型膠原占總膠原含量的比例（Ct.Col I）與WT組相比均無顯著性差異。
　　3、軟骨

9、麗春紅三色染色結(jié)果分析顯示，KO組軟骨含量與WT組相比呈下降趨勢。軟骨番紅O染色結(jié)果分析顯示，KO組軟骨含量（Cl.Ar）比WT組降低了0.04（mm2）。
　　4、松質(zhì)骨甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果分析顯示，KO組的新生骨骨量與WT組相比呈增加趨勢；KO組成骨細(xì)胞數(shù)量（Tb.Ob.N）比WT組增加了近一倍。皮質(zhì)骨甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果分析顯示，KO組成骨細(xì)胞數(shù)量（Ct.Ob.N）與WT組相比無顯著性差異。松質(zhì)骨四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記結(jié)果分析顯

10、示，KO組骨礦化沉積率（Tb.MAR）比WT組增加了1.7（μm/天）。皮質(zhì)骨四環(huán)素-鈣黃綠素雙熒光標(biāo)記結(jié)果分析顯示，KO組骨礦化沉積率（Ct.MAR）與WT組相比無顯著性差異。
　　5、TRAP染色結(jié)果分析顯示，生長板、松質(zhì)骨、皮質(zhì)骨部位的破骨細(xì)胞數(shù)量，在兩組之間未見顯著性差異。
　　6、免疫組化染色結(jié)果分析顯示，KO組CKIP-1蛋白表達(dá)為陰性，WT組表達(dá)為陽性。KO組松質(zhì)骨Axin2蛋白平均光密度值A(chǔ)xin2.Tb.M

11、OD比WT組增加了0.013；皮質(zhì)骨部位兩組表達(dá)均為陰性。KO組松質(zhì)骨COL I蛋白平均光密度值COL I.Tb.MOD比WT組增加了0.01，KO組皮質(zhì)骨COL I蛋白平均光密度值COL I.Ct.MOD與WT組相比無顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　CKIP-1負(fù)調(diào)控骨質(zhì)骨量變化，可能是其表達(dá)降低后通過促進成骨細(xì)胞分泌膠原總量和加快軟骨骨化速率，從而促進松質(zhì)骨的骨形成效果，而該基因不影響皮質(zhì)骨和破骨相關(guān)的骨吸收作用，為應(yīng)用該

12、基因治療OP選擇臨床適應(yīng)癥提供了理論依據(jù)。具體結(jié)論如下：
　　1、CKIP-1基因可負(fù)調(diào)控松質(zhì)骨骨量的變化，而對皮質(zhì)骨骨量的變化幾乎無影響。
　　2、CKIP-1基因可負(fù)調(diào)控松質(zhì)骨膠原總量，但對I型膠原占總膠原含量的比例的變化幾乎無影響。對皮質(zhì)骨膠原總量和I型膠原占總膠原含量的比例的變化幾乎無影響。
　　3、CKIP-1基因可正調(diào)控軟骨骨量。猜測：CKIP-1敲除后加快了軟骨骨化速率。
　　4、CKIP-1基因可