不同免疫狀態(tài)對小鼠脊髓損傷后修復(fù)的影響.pdf

1、免疫炎癥反應(yīng)是機體免疫系統(tǒng)抵御外界環(huán)境和維護自身的正常生理過程。而當(dāng)組織損傷時，它也是重要參與者，既可抵抗損傷處感染，又可為損傷組織提供細胞因子利于其再生修復(fù)。但免疫炎癥反應(yīng)在脊髓損傷后的作用備受爭議：一方面，脊髓損傷后激活的免疫炎癥反應(yīng)造成脊髓組織繼發(fā)性損傷惡化；另一方面，免疫炎癥反應(yīng)清除細胞碎片并分泌對神經(jīng)元起保護作用的細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）和神經(jīng)生長因

2、子（NGF）等，利于損傷脊髓組織的修復(fù)和再生。
　　但是籠統(tǒng)的說脊髓損傷后的自身免疫炎癥反應(yīng)好與壞是不科學(xué)的，因為免疫炎癥細胞需要相互聯(lián)系和影響，形成行使作用的免疫細胞網(wǎng)絡(luò)從而發(fā)揮免疫功能。即形成特定的免疫狀態(tài)，發(fā)揮特殊作用。不同免疫狀態(tài)下，自身免疫反應(yīng)有很大的差別。
　　我們前期實驗發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后的免疫炎癥反應(yīng)具有雙面性，在脊髓損傷早期，它們主要表現(xiàn)為破壞性作用，加重脊髓損傷；而時間進程的推進，又逐漸轉(zhuǎn)化為神經(jīng)保護性作用

3、，促進損傷組織的修復(fù)。這使我們想到是不是損傷區(qū)的免疫狀態(tài)發(fā)生了轉(zhuǎn)變，致使免疫炎癥反應(yīng)的作用也發(fā)生了轉(zhuǎn)型呢？如果的確存在轉(zhuǎn)變，那么又是那些類型的細胞起了關(guān)鍵性作用呢？
　　為了證實我們的假設(shè)，我們試圖通過分析不同免疫狀態(tài)對小鼠脊髓損傷修復(fù)的影響，尋找更利于脊髓損傷修復(fù)的免疫狀態(tài)、不同免疫狀態(tài)下?lián)p傷區(qū)的差異和發(fā)揮關(guān)鍵作用的細胞類型。為探索通過干預(yù)免疫反應(yīng)過程來治療脊髓損傷的治療策略提供更有力的理論基礎(chǔ)。
　　實驗中用到三種免疫狀

4、態(tài)下小鼠，即BALB/c、DO11.10小鼠和無胸腺裸鼠。其中BALB/c小鼠為正常免疫狀態(tài)小鼠，DO11.10小鼠和無胸腺裸鼠均為BALB/c遺傳背景下外周分別缺失正常功能CD4+T淋巴細胞和T淋巴細胞的小鼠。實驗分為兩部分：
　　1.不同免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷后運動功能恢復(fù)狀況的差異
　　通過SCI后11w的BBB評分和足跡分析兩種行為學(xué)實驗來評價三種免疫狀態(tài)小鼠運動功能恢復(fù)狀況。
　　2.不同免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷區(qū)

5、的細胞學(xué)和形態(tài)學(xué)差異
　　通過SCI后1w、2w和3w三個時間點的H&E染色、巨噬細胞免疫熒光三標(biāo)記實驗和T淋巴細胞的三標(biāo)記實驗，來分析三種免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷區(qū)免疫細胞的差異。
　　損傷區(qū)域殘存神經(jīng)纖維160（NF160）和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)的免疫熒光實驗，觀察三種小鼠脊髓損傷區(qū)局部形態(tài)學(xué)差異。
　　通過以上兩部分實驗，我們得到了如下的實驗結(jié)果：
　　1.三種免疫狀態(tài)對小鼠的脊髓損傷修復(fù)有明顯的影響

6、
　　首先，從BBB評分來分析運動功能恢復(fù)情況：無胸腺裸鼠一直明顯好于BALB/c和DO11.10小鼠（p＜0.01）；DO11.10小鼠在損傷后4w內(nèi)要好于持續(xù)低迷的BALB/c小鼠（p＜0.05），但4w后BALB/c小鼠恢復(fù)較快，到6w時幾乎追平了DO11.10小鼠，而到7w后已經(jīng)遠好于DO11.10小鼠（p＜0.01）。
　　足跡分析實驗也證實了三種免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷恢復(fù)的差異。SCI后2w，BALB/c小鼠后肢狀

7、況仍很差，基本無運動能恢復(fù)；DO11.10小鼠稍好，已有明顯的后足運動的趨勢和成一定頻率的左右側(cè)互換；裸鼠要好于前兩者，首先裸鼠足底可以著地，盡管不那么恒定，其次，可以看到不太穩(wěn)定的左右協(xié)調(diào)運動。到3w時，三組小鼠都出現(xiàn)了相應(yīng)的進步。BALB/c組可看到一定的步履，盡管主要靠足背側(cè)產(chǎn)生，偶爾會出現(xiàn)足底著地；而DO11.10小鼠則出現(xiàn)了一側(cè)足底著地和一定的協(xié)調(diào)性的現(xiàn)象；裸鼠依然是最穩(wěn)健的，基本全是足底著地，協(xié)調(diào)性也好于2w時的狀況。6w和

8、11w的步長和步間距統(tǒng)計分析結(jié)果基本與BBB評分結(jié)果相一致，裸鼠狀態(tài)明顯好于BALB/c和DO11.10組（p＜0.01）。11w時BALB/c小鼠稍好于DO11.10小鼠，但統(tǒng)計分析無顯著差異。
　　2.不同免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷區(qū)免疫細胞的存在明顯差異
　　損傷1w的H&E染色顯示DO11.10小鼠和裸鼠損傷區(qū)免疫炎性細胞稍多于BALB/c小鼠。巨噬細胞免疫熒光三標(biāo)記的實驗顯示，DO11.10小鼠和裸鼠損傷區(qū)M2型巨噬細胞

9、比BALB/c小鼠多，裸鼠損傷區(qū)及周邊CD11b陽性巨噬/小膠質(zhì)細胞要比BALB/c和DO11.10小鼠多。M1型巨噬細胞無明顯差異。T淋巴細胞三標(biāo)記的免疫熒光實驗結(jié)果則證實，三種小鼠免疫狀態(tài)有很大的差別。3w時，BALB/c小鼠脊髓損傷區(qū)已出現(xiàn)大量活化的CD4+、CD8+T淋巴細胞；DO11.10小鼠損傷區(qū)僅存在個別CD4+T淋巴細胞，但處于無活性狀態(tài)；裸鼠則基本無T淋巴細胞出現(xiàn)在損傷區(qū)及周邊。
　　2w時，NF160和GFAP

10、免疫熒光實驗也證實，三種免疫狀態(tài)小鼠脊髓損傷區(qū)局部存在形態(tài)學(xué)差異。GFAP免疫熒光實驗顯示DO11.10小鼠和裸鼠損傷邊界較清晰。而NF160陽性神經(jīng)纖維則在裸鼠脊髓損傷區(qū)存在較多。
　　通過以上兩部分實驗，我們認為BALB/c、DO11.10小鼠和無胸腺裸鼠三種不同的免疫狀態(tài)的確對其自身脊髓損傷恢復(fù)狀態(tài)產(chǎn)生了很大的影響。裸鼠的免疫狀態(tài)更利于其脊髓損傷修復(fù)。分析三種免疫狀態(tài)下脊髓損傷區(qū)免疫細胞我們發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶Ⅰ、CD11b陽性巨