CRISPR-Cas9介導(dǎo)MSTN基因敲除綿羊制備.pdf

1、肌肉性狀是動物的重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，肌肉生長過程受遺傳和環(huán)境雙重因素影響，研究表明肌肉的發(fā)生和發(fā)育過程涉及到諸多基因的調(diào)控作用，其中肌肉生成抑制素(Myostatin，MSTN)基因被認(rèn)為是與動物酮體重和瘦肉率有關(guān)的主要基因。MSTN基因，又名GDF-8(growth differentiation factor8)，屬于TGF-β（transforming growth factorβ，轉(zhuǎn)化生長因子β）超家族GDF亞族，高度表達(dá)于動物機(jī)

2、體骨骼肌中，是負(fù)向調(diào)控肌肉生長的重要基因，許多科學(xué)研究都表明該基因表達(dá)水平與肌肉重量的變化呈負(fù)相關(guān)，或突變可以造成肌肉過度肥大。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除MSTN基因，驗(yàn)證其對于肌細(xì)胞分化的影響作用，并利用單克隆細(xì)胞系篩選和體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)技術(shù)制備MSTN基因缺失表達(dá)的轉(zhuǎn)基因綿羊個體，研究結(jié)果為改善綿羊肌肉品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益提供參考價值，對于培育新型肉用綿羊品

3、種和豐富生物多樣性也具有理論和實(shí)踐意義。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.MSTN基因敲除載體構(gòu)建及活性驗(yàn)證:以綿羊肌肉組織總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR體外擴(kuò)增綿羊MSTN基因CDS序列，產(chǎn)物純化后送公司測序分析;設(shè)計在全基因組內(nèi)無同源性的靶位點(diǎn)gRNA，體外搭橋PCR構(gòu)建包含gRNA酶切DNA，以已知SSA活性的標(biāo)準(zhǔn)gRNA為對照，Cas9酶切反應(yīng)檢測luciferase信號;構(gòu)建高體外活性的sMSTN-Cas9/

4、gRNA敲除載體，以FuGene HD脂質(zhì)體按1∶3的比例轉(zhuǎn)染自1周齡小羊耳組織真皮層分離的SEFs（sheep ear fabroblasts，綿羊耳成纖維細(xì)胞），陽性細(xì)胞收集并提取基因組DNA，克隆出靶點(diǎn)前后1000bp左右片段，T7E1酶切檢測靶點(diǎn)活性。測序結(jié)果顯示MSTN基因克隆成功，與綿羊同源性為100％;體外活性共驗(yàn)證4個gRNA靶點(diǎn)，酶切活性分別50％、65％、5％、95％;選取最高的gRNA4靶點(diǎn)進(jìn)行內(nèi)源活性驗(yàn)證，結(jié)果表

5、明突變型基因組成功被T7E1酶剪切出相應(yīng)大小的條帶，顯示該靶點(diǎn)具有兼具外源和內(nèi)源活性，符合后期實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.MSTN基因敲除影響SMSCs成肌分化的研究:采用兩酶消化法分離sSMSC(SheepSkeletal muscle Satellite Cell，sSMSC)，采集剛出生小羊骨骼肌，經(jīng)肌膜剝除、肌絲消化和差速貼壁純化等步驟，在F5代獲得了較高純度的sSMSCs。間接免疫熒光檢測sSMSCs標(biāo)記基因Pax-7并統(tǒng)計陽性

6、細(xì)胞，結(jié)果為89.3％士2.8％的細(xì)胞為Pax-7陽性細(xì)胞，表明sSMSCs純度較高;1％低血請濃度饑餓誘導(dǎo)sSMSCs顯示在72h可以得到大量分化早期的肌管細(xì)胞。將MSTN-Cas9/gRNA4載體轉(zhuǎn)染sSMSCs，puro連續(xù)篩選后饑餓誘導(dǎo)72h，間接免疫熒光檢測成肌分化早期標(biāo)志Desmin蛋白，結(jié)果顯示:1％低濃度血清饑餓誘導(dǎo)處理72h，對照組和敲除組肌管形成效率分別為11.2±1.3％、19.5±2.1％，肌管平均長度為22±3

7、.4μm、47±2.8μm，顯示MSTN基因敲除可以在數(shù)量和長度上促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化。
　　3.無標(biāo)記敲除MSTN基因單克隆細(xì)胞系制備:為了符合轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)規(guī)范和要求，對現(xiàn)有載體進(jìn)行改造，利用限制性內(nèi)切酶MLuⅠ和SpeⅠ進(jìn)行雙酶切反應(yīng)切除包含標(biāo)記基因GFP和puro片段，獲得無標(biāo)記質(zhì)粒。以200V電壓轉(zhuǎn)染SEFs后利用細(xì)玻璃針和口吸管裝置，接種單個細(xì)胞至96孔板每小孔中使其貼壁生長并擴(kuò)大成細(xì)胞系。以各單細(xì)胞系基因組DNA為模

8、板，PCR克隆靶點(diǎn)上下游片段，送公司測序。實(shí)驗(yàn)接種4個96孔，一共觀察到107個小孔內(nèi)有細(xì)胞存在，其中93孔為單細(xì)胞，最終成功增殖的細(xì)胞系共61株;測序結(jié)果經(jīng)UCSC序列比對共得到3個突變型細(xì)胞系，突變率約為9.3％;其中18號細(xì)胞株靶點(diǎn)序列21bp正向缺失，15號細(xì)胞株發(fā)生29個堿基錯配，16號細(xì)胞株在靶點(diǎn)前11bp往后序列全部錯配。
　　4.SCNT法制備轉(zhuǎn)基因克隆綿羊:選擇突變堿基較多的16號為核移植供體細(xì)胞，體外分離綿羊卵

9、母細(xì)胞并成熟19-22h，挑選排第一極體的成熟卵母細(xì)胞為受體細(xì)胞。顯微鏡下去除受體細(xì)胞核并將供體細(xì)胞注入受體細(xì)胞膜與透明帶之間，電擊使兩者融合，融合胚胎經(jīng)孤雌激活和體外發(fā)育后，選擇均勻卵裂的胚胎手術(shù)移植入發(fā)情母羊排卵側(cè)卵巢連接的輸卵管內(nèi)。手術(shù)后3個月，利用B超檢測母羊妊娠情況。本次實(shí)驗(yàn)中，綿羊卵母細(xì)胞體外成熟率、供受體融合率以及卵裂率平均值分別為66.0％、69.5％、80.9％，均達(dá)到了國內(nèi)平均水平;核移植手術(shù)共移植415枚胚胎至20