應(yīng)用CRISPR-Cas9技術(shù)抑制偽狂犬病病毒的再激活.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的多種家畜及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)障礙為主要特征的急性傳染病。PRV是一種嗜神經(jīng)性病毒，感染豬只后，可在其體內(nèi)建立潛伏感染。疫苗在該病的防控中發(fā)揮了重要的作用，但是現(xiàn)有疫苗不能夠阻止?jié)摲腥镜慕⑴c再激活，而且血清學(xué)方法不能夠檢測(cè)到處于潛伏感染狀態(tài)的PRV。在一定條件下，潛伏狀態(tài)的PRV可以被重新激

2、活，從而導(dǎo)致排毒并引發(fā)疫情，這非常不利于PR的防控及根除。因此，研制一種能夠清除潛伏感染狀態(tài)PRV的方法極為必要。
　　本研究首先利用同源重組的方法構(gòu)建了一株重組報(bào)告病毒rPRVTJ-US9-EGFP，經(jīng)熒光觀(guān)察、PCR和一步生長(zhǎng)曲線(xiàn)鑒定，獲得了一株能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光、且生長(zhǎng)特性與親本病毒一致的報(bào)告病毒。我們通過(guò)分離新生鼠背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglion，DRG)獲取感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞，并以抗βⅢ-tubulin抗體

3、利用間接免疫熒光試驗(yàn)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行了鑒定。為了獲得純凈的感覺(jué)神經(jīng)細(xì)胞，我們利用抑制有絲分裂的藥物阿糖胞苷(Cytosine arabinoside，Ara-C)對(duì)非神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行處理，并對(duì)其濃度進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，5μM Ara-C為最適處理濃度。同時(shí)研究了抗病毒藥物阿昔洛韋(Acyclovir，ACV)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性，結(jié)果表明01～07mM的ACV對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。
　　我們利用報(bào)告病毒在神經(jīng)細(xì)胞上構(gòu)建潛伏模型，3個(gè)

4、感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection，MOI)和5個(gè)ACV處理濃度以棋盤(pán)滴定法進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，以MOI=0001感染感覺(jué)神經(jīng)元，05mMACV處理7d后，被感染細(xì)胞中的熒光消失，說(shuō)明可能建立潛伏感染。隨后，我們收集PRV的潛伏感染樣品和裂解樣品，對(duì)病毒基因組拷貝數(shù)、上清中病毒滴度和病毒各時(shí)期基因的表達(dá)進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明熒光消失時(shí)細(xì)胞中存在病毒基因組但病毒不能復(fù)制、不產(chǎn)生感染性病毒粒子，確實(shí)處于潛伏感染狀態(tài)。

5、當(dāng)用10μM的在激活藥物L(fēng)Y294002刺激時(shí)，潛伏感染的PRV可被再激活進(jìn)入裂解感染狀態(tài)。
　　然后我們選取了對(duì)PRV復(fù)制、再激活有影響的病毒基因UL9、UL42、UL54和VP16。構(gòu)建含有靶基因的真核表達(dá)載體，以蛋白表達(dá)的方式初步篩選了sgRNA的編輯效果。結(jié)果表明，UL9-sgRNA1、UL9-sgRNA3、UL54-sgRNA1、UL54-sgRNA2和UL54-sgRNA3均可明顯降低靶基因的蛋白表達(dá)水平。并構(gòu)建了一系