利用CRISPR-Cas9技術(shù)制備MSTN基因敲除綿羊.pdf

1、肌肉生長抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生長發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，該基因突變使個體表現(xiàn)為“雙肌”表型。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除綿羊MSTN基因，成功制備基因編輯綿羊，為未來的綿羊種質(zhì)創(chuàng)新提供了素材。
　　(1)CRISPR/Cas9-MSTN-gRNA的設(shè)計及活性驗證:從綿羊MSTN基因CDS篩選出10個靶向位點(diǎn)，對其中4個靶向位點(diǎn)構(gòu)建Cas9/gRNA，并在體外環(huán)境驗證活性后得到最高體外切割效率(55％)

2、的MSTN-gRNA-1靶向位點(diǎn)。
　　(2)精子來源對卵母細(xì)胞體外受精效果的影響:附睪鮮精和凍精卵裂率分別為85.03％、7125％，附睪鮮精卵裂率顯著高于凍精(P＜0.05)。附睪鮮精和凍精桑囊率分別為4874％、3176％，附睪鮮精顯著高于凍精(P＜0.05)。結(jié)果表明，綿羊體外受精受精子類型影響較大，采用附睪鮮精可獲得理想卵裂率和桑囊率。
　　(3)精卵共培養(yǎng)時間(18h、221h、24h、26h)對卵母細(xì)胞體外受精

3、效果的影響，精卵共培養(yǎng)18h、22h、24h、26h卵裂率分別為55.13％、83.06％、81.09％、7391％，22小時與18h差異性極顯著(P＜0.01)，與26h差異性顯著(P＜005)，與24h差異性不顯著(P＞05)。精卵共培養(yǎng)18h、22h、24h、26h桑囊率分別為27.91％、4466％、35.33％、2823％，22小時與18h、24h、26h均差異性顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，22h卵母細(xì)胞體外受精較好。

4、r>　　(4)不同時間(9h、10h、11h、12h)注射外源RNA對胚胎發(fā)育的影響:9h、10h、11h、12h的卵裂率分別為42.95％、32.26％、20％、13.56％，9h與11h、12h差異性極顯著(P＜001)，與10h差異性顯著（P＜0.05）。9h、10h、11h、12h的桑囊率分別為37.50％、14.44％、087％、12.5％，9h與10h、11h、12h均差異性極顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明，精卵共培養(yǎng)9h進(jìn)

5、行1細(xì)胞受精卵注射較好。
　　(5)注射不同濃度的外源RNA對胚胎發(fā)育的影響:濃度①(Cas9:50ng/ul，gRNA.25ng/uL)、②(Cas9:25ng/uL，gRNA:12.5ng/uL)、③(Cas9.12.5ng/uL，gRNA:6.25ng/uL)的的卵裂率分別為41.67％、57.25％、59.09％，②與①差異性顯著(P＜0.05)，與③相比卵裂率降低，但差異性不顯著(P＞005)。①、②、③的桑囊率分別為2

6、0％、3797％、38.46％，②與①差異性極顯著(P＜001)，與③相比，桑囊率有所下降，但差異性不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明，為達(dá)到卵裂率及桑囊率高的效果，③濃度較好。
　　(6)綿羊胚胎中g(shù)RNA-Cas9切割效率驗證:采用注射濃度Cas9:12.5ng/uL，gRNA6.25ng/uL時，gRNA-Cas9mix(mRNAmix)對綿羊胚胎MSTN基因切割效率為23.5％。
　　(7)注射后的胚胎發(fā)育到囊胚后，經(jīng)