利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建ApoE---豬模型.pdf

1、心腦血管疾病是全世界主要的致死性疾病，動脈粥樣硬化是其重要的病理基礎(chǔ)。高脂血癥和高膽固醇血癥被認為是動脈粥樣硬化發(fā)病及發(fā)展的重要因素。載脂蛋白E(ApoE)在膽固醇和脂蛋白的轉(zhuǎn)運和代謝中發(fā)揮重要作用。ApoE基因敲除小鼠的廣泛應(yīng)用，使得動脈粥樣硬化早期病理機制的研究取得了很大進展。但ApoE敲除小鼠與人類在動脈粥樣硬化病理機制上相去甚遠。豬因為在解剖學和生理上和人類似，適合于建立動脈粥樣硬化大動物模型。
　　目的:通過敲除豬的Ap

2、oE基因，建立國際上首批ApoE基因敲除豬，培育動脈粥樣硬化的豬模型，能更好地研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機理，同時為進一步研究動脈粥樣硬化的預防治療打下基礎(chǔ)。
　　方法:設(shè)計合適的ApoE基因敲除的CRISPR/Cas9靶點，并組裝CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒;通過CRISPR/Cas9質(zhì)粒與表達G418抗性的tdTomato質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細胞，經(jīng)過抗性篩選和PCR產(chǎn)物測序的方式鑒定出ApoE基因雙敲的單細胞克隆;以篩選獲得

3、的ApoE基因雙敲的豬胎兒成纖維細胞單克隆作為體細胞核移植供體，通過體細胞核移植(SCNT)技術(shù)，構(gòu)建國際上首例ApoE基因雙敲的克隆豬。對于構(gòu)建的克隆小豬，提取耳部組織基因組DNA后，PCR測序鑒定其ApoE的基因型。
　　結(jié)果:根據(jù)選取的ApoE靶點位置，設(shè)計并成功組裝CRISPR/Cas9打靶質(zhì)粒，CRISPR/Cas9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染豬原代成纖維細胞，篩選得到ApoE等位基因雙突變的中華小型豬單細胞克隆個數(shù)為14個，ApoE等位基