CRISPR-Cas9靶向編輯技術的優(yōu)化及其在干細胞中的應用.pdf

1、CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯技術的發(fā)現(xiàn)發(fā)展，為人類疾病尤其是罕見遺傳病的基因治療提供了更有利的技術平臺，為精準醫(yī)療提供了新策略。如何最大限度地降低和評估脫靶效應、提高其在干細胞中的基因編輯效率，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)走向臨床應用的前提和關鍵。
　　本論文借助細胞中DNA雙鏈斷裂(DSBs)后自發(fā)進行的非同源末端連接(NHEJ)或同源介導的雙鏈修復(HDR)兩種機制，將帶有目標基因序列向導RNA（gRNA）的一個或多個C

2、RISPR/Cas9系統(tǒng)導入人的細胞系和干細胞中，誘發(fā)DNA雙鏈斷裂，進而誘發(fā)基因序列的插入、修飾和缺失，提高靶向編輯的效率和準確性;同時利用整合酶缺陷型慢病毒載體(IDLVs)能夠優(yōu)先識別DNA雙鏈斷裂的特點，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)產生的脫靶位點進行了評估，并優(yōu)化了干細胞中的基因編輯效率。
　　第1章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)中gRNA脫靶效應評估新方法的建立
　　近年來，CRISPR/Cas9系統(tǒng)廣泛地應用于動植

3、物的基礎研究中，更有望在未來應用于臨床疾病治療。而脫靶效應的存在始終是一個后患，已有的基于脫靶位點的網絡分析工具及體外驗證方法往往無法體現(xiàn)細胞內的真實脫靶情況，為了更安全、更精準的應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對經過基因編輯后的細胞進行全面的脫靶位點篩查，顯得非常的重要。已有文獻報道，線性的雙鏈IDLV基因組能夠識別經過ZFNs系統(tǒng)誘導產生的雙鏈斷裂，并通過非同源末端連接的修飾方式，整合到雙鏈斷裂位點，進而用于檢測ZFNs系統(tǒng)的脫靶效

4、應。我們將其創(chuàng)新性的應用在CRISPR/Cas9脫靶位點的全基因組篩查中。
　　針對兩個突變后會導致疾病的靶基因，WAS綜合征基因(WAS)和酪氨酸氨基轉移酶基因（TAT），分別設計了3個gRNAs及一對TALEN作為比較。經過CRISPR/Cas9或TALEN轉染過的HEK293T細胞，第二天轉導入攜帶氨基糖苷類抗生素——嘌呤霉素(puromycin)篩選標記的IDLV病毒，經篩選后收集陽性克隆的全基因組DNA，利用非限制性(n

5、r)線性擴增介導的PCR(LAM-PCR)結合深度測序(deep sequencing)的方法，定位陽性細胞全基因組中成簇的IDLV插入位點(CLISs)，并對各位點進行分析。
　　發(fā)現(xiàn)由簡短的gRNA識別靶向基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，其脫靶情況差異很大;當gRNA比識別位點的DNA序列多一到兩個或者少一到兩個堿基時，若能在gRNA與DNA序列結合時形成凸起(bulge)，這樣的脫靶位點仍然能夠產生雙鏈斷裂，像這種表面上存

6、在大于4個錯配堿基的錯配位點，目前的網絡運算法則是無法預測到的。
　　本研究證實并檢測了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶問題。該方法非常靈敏，可以檢測到切割效率不低于1％的脫靶位點，雖然無法識別全部的脫靶位點，此方法卻是在全基因組水平上無偏的篩查。作為一種生物學的分析方法，該方法對CRISPR/Cas9系統(tǒng)的改進提供了新思路與評測平臺。
　　第2章多能干細胞中CRISPR/Cas9介導的高效率的同源重組修飾
　　多能干

7、細胞(PSCs)如胚胎干細胞(ESCs)和誘導性多潛能干細胞(iPSCs)可用于疾病模型的建立，為研究發(fā)育生物學、疾病的病理機制提供了一個可以在培養(yǎng)皿中操作的平臺。攜帶疾病基因的PSCs可分化為疾病特異性的細胞或組織，進行高通量毒理/藥效篩選，有望填補動物模型與臨床試驗的中間環(huán)節(jié)，節(jié)約藥物開發(fā)成本。以往的研究中，在人PSCs中進行準確基因編輯的效率很低，本研究旨在提高人PSCs中的基因定點修飾效率。
　　CRISPR/Cas9系統(tǒng)

8、可以在目標基因誘發(fā)雙鏈斷裂，存在足夠模板序列的情況下，可促使細胞通過同源重組的方式進行準確編輯。依據此原理，針對WAS基因第6個內含子的高突變位點區(qū)域，設計了2個gRNAs，結合IDLV攜帶的帶有篩選標記的模板序列，對目標區(qū)域進行準確的基因修飾。
　　發(fā)現(xiàn)通過IDLV攜帶模板序列的方法，經篩選后，同源重組的正確率效率高達50％;推測并驗證了晶狀體上皮源性生長因子(LEDGF/p75)，作為細胞內促進同源重組修復方式的主要蛋白，可與

9、IDLV作用元件中的整合酶(IN)相結合，將模板序列拉到雙鏈斷裂位點，進而促進同源重組修復的發(fā)生。
　　本研究優(yōu)化了人PSCs中精確基因編輯的效率，并首次提出并驗證了LEDGF/p75蛋白在IDLV攜帶模板序列促進同源重組過程中的作用。
　　第3章造血干細胞中CRISPR/Cas9介導的靶向刪除在β-globin疾病治療中的應用
　　β地中海貧血(β-thalassemia)和鐮刀型貧血癥(SCD)兩種β-globin

10、異常疾病，是研究得比較清楚的兩種單基因遺傳性疾病。都是由于β-globin珠蛋白亞基突變而導致的成人血紅蛋白(HbA)異常，進而影響血紅蛋白的功能。臨床上發(fā)現(xiàn)，病情的嚴重程度與患者自身胎兒血紅蛋白(HbF)的表達水平密切相關，因此可以通過增加患者體內HbF的含量來緩解β-globin疾病的癥狀。以往的研究發(fā)現(xiàn)，BCL11A基因第二個內含子中一段約10kb的DNA序列，在正常人紅系發(fā)育過程中，可以特異性增強BCL11A基因的表達，從而抑制

11、了HbF中的組成元件——γ-globin的表達。因此，通過刪除這個特異性的增強子，減少BCL11A基因的表達，進而增加HbF含量的方法，可以作為緩解β-globin疾病病情的新策略。
　　針對BCL11A基因的特異性增強子區(qū)域，在其兩側分別設計了一對gRNA，通過同時誘發(fā)此區(qū)域的的兩端發(fā)生雙鏈斷裂，達到刪除DNA片段的目的。將包含兩個gRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)導入HUDEP-2(Human Umbilical Cord

12、BloodDerived Erythoid Progenitor-2)細胞系，構建純合型和雜合型細胞株，進而檢驗BCL11A與γ-globin的表達水平及它們之間的關系;此外，利用同樣的系統(tǒng)，在CD34+造血干細胞中進行了驗證。
　　發(fā)現(xiàn)造血干細胞中的大片段基因刪除效率遠遠低于細胞系;增強子缺失的細胞株，純合型中γ-globin的表達水平在β類globin中的比例，從對照組的1％提高到45％，雜合子則提高到20％左右;造血干細胞中