利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除HeLa細(xì)胞的DHRS4基因.pdf

1、輔酶Ⅱ依賴(lài)性視黃醛脫氫還原酶（NRDR）是從兔肝中發(fā)現(xiàn)并純化的一種酶，能有效地氧化視黃醇與還原視黃醛。視黃醇在體內(nèi)經(jīng)兩步代謝生成維甲酸，其中間代謝產(chǎn)物為視黃醛。視黃醛的合成反應(yīng)是體內(nèi)維甲酸合成的限速步驟，因此N RDR在維持生物體內(nèi)維甲酸的平衡過(guò)程中起著重要作用。NRDR也在人以及其他哺乳動(dòng)物中普遍表達(dá)，由DHRS4基因編碼。其除參與維甲酸代謝外，對(duì)類(lèi)固醇激素、α-雙羰基化合物等也具有催化活性。
　　全反式維甲酸是維生素A的代謝產(chǎn)

2、物，是脊椎動(dòng)物體內(nèi)重要的生物活性物質(zhì)，通過(guò)與其核內(nèi)受體結(jié)合調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、形態(tài)發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)等生理過(guò)程。臨床上，維甲酸類(lèi)化合物已廣泛應(yīng)用于預(yù)防及治療一些惡性腫瘤，包括乳腺癌、皮膚癌、宮頸癌和早幼粒細(xì)胞白血病等。體內(nèi)維甲酸類(lèi)化合物的平衡受飲食及其相關(guān)代謝酶等因素的影響，但其在體內(nèi)具體的調(diào)控機(jī)制仍有待研究。
　　成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)（CRISPR，Clustered regularly interspaced

3、 short palindromic repeats）是一種來(lái)自細(xì)菌降解外源DNA的免疫機(jī)制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中，CRISPR系統(tǒng)需要CRISPR相關(guān)蛋白（Cas蛋白）共同發(fā)揮作用，Cas9蛋白含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，可以分別切割DNA兩條單鏈。crRNA（CRISPR-derived RNA）與tracrRNA（trans-activating crRNA）通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，該復(fù)合物能夠引導(dǎo)核酸酶Ca

4、s9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。通過(guò)人為設(shè)計(jì)這兩種特殊的RNA，我們可以合成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（singleguide RNA），從而引導(dǎo)Cas9蛋白對(duì)DNA進(jìn)行定點(diǎn)切割。
　　我們實(shí)驗(yàn)室在DHRS4基因結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其表達(dá)產(chǎn)物NRDR蛋白功能方面進(jìn)行了大量細(xì)致的研究工作，取得了一定的成果。目前亟需建立DHRS4或NRDR敲除的細(xì)胞和動(dòng)物模型。本課題利用CRISPR/Cas9技術(shù)，建立了敲除DHRS4